合作专家 | 杨晶晶硕士
公共卫生 福建医科大学
审核专家 | 于涛博士
生物化学分子生物 中国科学院大学
原理
根据靶基因的 DNA 模板在体外转录形成两条互补 RNA 链，随后将所得的 RNA 链退火形成 dsRNA。
用途
沉默靶基因，靶基因下游调控研究。
材料与仪器
试剂：
琼脂糖凝胶、电泳缓冲液、ATP、CTP、GTP、UTP、DTT、DNA marker、OTT、高保真 PCR Mix 、dNTP 混合液、无水乙醇、DNA 上样缓冲液（6X）、TBE（5X）、RNase free water、引物、PCR 缓冲液、PCR 管、各规格无酶 EP 管、苯酚 : 氯仿（1 : 1）、DNA 酶 I、乙酸钠、Gold View 核酸染色剂、T7 聚合酶、T7 转录缓冲液（10X）、全基因组 DNA。
设备：
核酸电泳仪、PCR 仪、金属浴、凝胶成像系统。
步骤
一、制备模板
1、查阅基因序列库、下载目的基因的序列。
2、选择长度为 400~800 bp 的目的基因序列作为体外转录的模板。
3、将序列进行 BLAST 比对，分析其特异性，特异性不好则需要重新选取。
4、用 Primer5.0 设计目的基因的引物。
5、将 T7 启动子序列（5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′）加到两条引物的 5' 端，需要准备两队引物分别带有 T7 启动子序列或者不带。
6、分别用每对引物进行 PCR 合成 DNA 模板，在 200 μl 的 RNAse free 的 EP 管中配置 PCR 体系：
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模板 DNA |
基因组 DNA：6 ug |
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RNase Free dH2O |
Add to 100 μl |
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SYBR Taq 酶（2×） |
50 μl |
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正向引物（10 μM） |
5 μl |
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反向引物（10 μM） |
5 μl |
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总反应体积 |
100 μl |
7、混匀后涡旋离心到管底，放入 PCR 仪中，进行如下扩增：
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Cycle |
Cycle Point |
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Hold 94 ℃，5 min |
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Cycling（25 repeats） |
Step1：94 ℃，hold 30 s |
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Step2：64 ℃，hold 30 s |
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Step3：72 ℃，hold 10 s |
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Hold 72 ℃，5 min |
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Hold 72 ℃，5 min |
8、制备 1% 的琼脂糖凝胶电泳
9、反应结束后将 5 μl 的 PCR 产物与 1 μl DNA 缓冲液（6X）混匀，然后加到上样孔中进行电泳。
10、将剩余的 PCR 产物转移至一个新的 800 μl EP 管中，加入 1/10 体积的乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2）和 2.5 倍体积的无水乙醇，涡旋混匀，在 -20 ℃ 或者更低的温度下放置 30 min 以上，使 PCR 产物沉淀。4 °C 16 000 g 离心 30 min，弃去上清。用 1 ml 70％ 乙醇洗沉淀以去除残留的盐类。4 ℃ 16 000 g 离心 5 min，尽量去上清，然后将离心管开盖放置数分钟使乙醇挥发。
11、将 DNA 沉淀溶解于 50 μl 水。
二、制备 dsRNA
1、将 T7RNA 聚合酶置于冰上，按下表配置 100 μl 体外转录体系：
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RNase Free dH2O |
56.5 μl |
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T7 转录缓冲液（10X） |
10 μl |
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PCR 模板 DNA |
5 μl |
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ATP ( 100 mmol/L） |
5 μl |
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CTP ( 100 mmol/L） |
5 μl |
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UTP ( 100 mmol/L） |
5 μl |
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GTP ( 100 mmol/L） |
8 μl |
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OTT （1 mol/L) |
0.5 μl |
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T7RNA 聚合酶 |
0.5 μl（100 U） |
2、将试剂离心到 EP 管底部，37 ℃ 孵育 120 min。
3、加入 5 μl DNA 酶 I，涡旋将其离到管底，37 ℃ 孵育 30 min。
4、加入等体积的酚 : 氯仿（1 : 1），涡旋 30 s。4 ℃ 最大转速离心 15 min，将上层液相转移至一个新的 1.5 ml 微量离心管中。
5、向液相中加入 1/10 体积的乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2）和 2.5 倍体积的无水乙醇，涡旋混匀，在 -20 ℃ 放置 30 min 以上，使 PCR 产物沉淀。4 ℃ 16 000 离心 30 min。
6、弃去上清。加入 1 ml 70％ 乙醇洗涤沉淀，以去除残留的盐类。4 ℃ 16 000 离心 5 min 使 RNA 沉淀，最大限度地弃去上清（70％ 乙醇），然后将离心管开盖放置数分钟使乙醇挥发。
7、将 RNA 沉淀溶解于 100 μl 的无核酸酶水中。利用 Nanodrop 测量 RNA 的浓度和纯度。
8、使两条链复性，生成 0.5 μmol/L 的 dsRNA 溶液：
9、将 EP 管放在金属浴上 95℃，1 min，自然冷却至室温。
10、向液相中加入 1/10 体积的乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2）和 2.5 倍体积的无水乙醇，涡旋混匀，在 -20 ℃ 放置 30 min 以上，使 PCR 产物沉淀。4 ℃ 16 000 g 离心 30 min。弃去上清。加入 1 ml 70％ 乙醇洗涤沉淀，以去除残留的盐类。4 ℃ 16 000 g 离心 5 min 使 RNA 沉淀，最大限度地弃去上清（70％ 乙醇），然后将离心管开盖放置数分钟使乙醇挥发。
11、用 RNase free water 溶解 RNA，置于 -80 ℃ 保存备用。
三、dsRNA 完整性检测
1、制备 1% 的琼脂糖凝胶电泳
2、反应结束后将 5 μl 的 PCR 产物与 1 μl DNA 缓冲液（6X）混匀，然后加到上样孔中进行电泳。
3、将凝胶取下，在中 Gold View 核酸染色剂进行显色，然后在 1X TBE 中漂洗 3 次，每次 5 min，上机进行检测。
注意事项
1、提 RNA 时浓度太低，可以在提取过程中适当加长沉淀时间，沉淀过夜，或者加微量糖原。
2、检测 dsRNA 完整性过程发现有其他条带，可能是 RNA 降解或者转录出来的 RNA 不特异。
3、目的基因序列不宜过长，否则特异性降低，容易会产生杂带污染。
常见问题
问题 1：提 RNA 时浓度太低？
答：可以适当提高模板浓度，延长体外转录时间，以及在提取过程中适当加长沉淀时间，沉淀过夜。
问题 2：dsRNA 完整性检测过程中发现杂带？
答：实验耗材均采用无 RNA 酶试剂、EP 管、移液器吸头，避免降解目的 dsRNA。
来源：丁香实验
