体外转录法合成 dsRNA

根据靶基因的 DNA 模板在体外转录形成两条互补 RNA 链，随后将所得的 RNA 链退火形成 dsRNA。

沉默靶基因，靶基因下游调控研究。

试剂：

琼脂糖凝胶、电泳缓冲液、ATP、CTP、GTP、UTP、DTT、DNA marker、OTT、高保真 PCR Mix 、dNTP 混合液、无水乙醇、DNA 上样缓冲液（6X）、TBE（5X）、RNase free water、引物、PCR 缓冲液、PCR 管、各规格无酶 EP 管、苯酚 : 氯仿（1 : 1）、DNA 酶 I、乙酸钠、Gold View 核酸染色剂、T7 聚合酶、T7 转录缓冲液（10X）、全基因组 DNA。

设备：

核酸电泳仪、PCR 仪、金属浴、凝胶成像系统。

一、制备模板

1、查阅基因序列库、下载目的基因的序列。

2、选择长度为 400~800 bp 的目的基因序列作为体外转录的模板。

3、将序列进行 BLAST 比对，分析其特异性，特异性不好则需要重新选取。

4、用 Primer5.0 设计目的基因的引物。

5、将 T7 启动子序列（5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′）加到两条引物的 5' 端，需要准备两队引物分别带有 T7 启动子序列或者不带。

6、分别用每对引物进行 PCR 合成 DNA 模板，在 200 μl 的 RNAse free 的 EP 管中配置 PCR 体系：

7、混匀后涡旋离心到管底，放入 PCR 仪中，进行如下扩增：

8、制备 1% 的琼脂糖凝胶电泳

9、反应结束后将 5 μl 的 PCR 产物与 1 μl DNA 缓冲液（6X）混匀，然后加到上样孔中进行电泳。

10、将剩余的 PCR 产物转移至一个新的 800 μl EP 管中，加入 1/10 体积的乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2）和 2.5 倍体积的无水乙醇，涡旋混匀，在 -20 ℃ 或者更低的温度下放置 30 min 以上，使 PCR 产物沉淀。4 °C 16 000 g 离心 30 min，弃去上清。用 1 ml 70％ 乙醇洗沉淀以去除残留的盐类。4 ℃ 16 000 g 离心 5 min，尽量去上清，然后将离心管开盖放置数分钟使乙醇挥发。

11、将 DNA 沉淀溶解于 50 μl 水。

二、制备 dsRNA

1、将 T7RNA 聚合酶置于冰上，按下表配置 100 μl 体外转录体系：

2、将试剂离心到 EP 管底部，37 ℃ 孵育 120 min。

3、加入 5 μl DNA 酶 I，涡旋将其离到管底，37 ℃ 孵育 30 min。

4、加入等体积的酚 : 氯仿（1 : 1），涡旋 30 s。4 ℃ 最大转速离心 15 min，将上层液相转移至一个新的 1.5 ml 微量离心管中。

5、向液相中加入 1/10 体积的乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2）和 2.5 倍体积的无水乙醇，涡旋混匀，在 -20 ℃ 放置 30 min 以上，使 PCR 产物沉淀。4 ℃ 16 000 离心 30 min。

6、弃去上清。加入 1 ml 70％ 乙醇洗涤沉淀，以去除残留的盐类。4 ℃ 16 000 离心 5 min 使 RNA 沉淀，最大限度地弃去上清（70％ 乙醇），然后将离心管开盖放置数分钟使乙醇挥发。

7、将 RNA 沉淀溶解于 100 μl 的无核酸酶水中。利用 Nanodrop 测量 RNA 的浓度和纯度。

8、使两条链复性，生成 0.5 μmol/L 的 dsRNA 溶液：

9、将 EP 管放在金属浴上 95℃，1 min，自然冷却至室温。

10、向液相中加入 1/10 体积的乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2）和 2.5 倍体积的无水乙醇，涡旋混匀，在 -20 ℃ 放置 30 min 以上，使 PCR 产物沉淀。4 ℃ 16 000 g 离心 30 min。弃去上清。加入 1 ml 70％ 乙醇洗涤沉淀，以去除残留的盐类。4 ℃ 16 000 g 离心 5 min 使 RNA 沉淀，最大限度地弃去上清（70％ 乙醇），然后将离心管开盖放置数分钟使乙醇挥发。

11、用 RNase free water 溶解 RNA，置于 -80 ℃ 保存备用。

三、dsRNA 完整性检测

1、制备 1% 的琼脂糖凝胶电泳

2、反应结束后将 5 μl 的 PCR 产物与 1 μl DNA 缓冲液（6X）混匀，然后加到上样孔中进行电泳。

3、将凝胶取下，在中 Gold View 核酸染色剂进行显色，然后在 1X TBE 中漂洗 3 次，每次 5 min，上机进行检测。

1、提 RNA 时浓度太低，可以在提取过程中适当加长沉淀时间，沉淀过夜，或者加微量糖原。

2、检测 dsRNA 完整性过程发现有其他条带，可能是 RNA 降解或者转录出来的 RNA 不特异。

3、目的基因序列不宜过长，否则特异性降低，容易会产生杂带污染。

问题 1：提 RNA 时浓度太低？

答：可以适当提高模板浓度，延长体外转录时间，以及在提取过程中适当加长沉淀时间，沉淀过夜。

问题 2：dsRNA 完整性检测过程中发现杂带？

答：实验耗材均采用无 RNA 酶试剂、EP 管、移液器吸头，避免降解目的 dsRNA。