植物细胞器的荧光标记及观察

植物细胞内含有丰富的细胞器，包括液泡、质体、线粒体、高尔基体、核糖体、内质网、微管和微丝、细胞核等，其中，液泡和质体是植物细胞特有的细胞器。随着细胞生物学研究的深入，植物细胞内大多数的细胞器都可以被特异性的荧光染料所标记，从而极大地方便了人们对细胞内的生命活动的探索。

目前，植物细胞中很多细胞器都可以被染料特异性标记，有些染料可以透过细胞膜，被用来标记活细胞内的特定细胞器，有些染料则不能透过细胞膜，只能标记死细胞内的特定细胞器，下表中列举了一些常用的细胞器染料（表26-1）。

表 26-1 常用细胞器的荧光染料及染色原理

细胞器	染料	活细胞/死细胞	染色原理
细胞核	DAPI（4'，6-diamidino-2-phenylindole）	活细胞/死细胞	DAPI为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链 DNA 结合而发挥标记的作用，产生比 DAPI 自身强 20 多倍的荧光，显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞
液泡	中性红	活细胞	中性红是一种弱碱性 pH 指示剂，变色范围为 pH 6.4~8.0（由红变黄）。在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中运输，由于液泡在一般情况下呈酸性反应，因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色。在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色；在死细胞中由于原生质变性凝固，细胞液不能维持在液泡内，因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象，相反，中性红的阳离子，却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色
线粒体	詹纳斯绿B（Janus green B）	活细胞	Janus green B 的染色是由于线粒体中的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态呈蓝绿色；而在周围的细胞质中染料被还原成无色的色基
微丝	鬼笔环肽（phalloidin）	活细胞/死细胞	鬼笔环肽与微丝能够特异性结合，使微丝纤维稳定而抑制其功能。荧光标记的鬼笔环肽可特异性显示细胞内的微丝

黄豆幼苗根尖（绿豆或水稻也可），把黄豆培育在培养皿中潮湿的滤纸上，使其发芽，直到胚根伸长 1 cm 以上。洋葱鳞茎表皮细胞。

器具：

① 显微镜

② 镊子

③ 载玻片

④ 盖玻片

试剂：

① Ringer 溶液

② 1% 中性红溶液

③ 1/3000 中性红染色液

④ 1%、1/5000 的 Janus green B 染色液

⑤ 4% 多聚甲醛溶液（新鲜配制）

⑥ DAPI 染色液

植物细胞器的荧光标记及观察的基本过程可分为如下几步：

（一） 植物细胞液泡的中性红染色及观察

1. 观察黄豆幼苗根尖细胞的液泡

用双面刀片把初生的黄豆幼苗根尖（1~2 cm 长）小心切一纵断面，放入载玻片中央的 1/3000 中性红染色液中，染色 5~100 min。吸去中性红染液，换上 Ringer 溶液，盖上盖片观察。可见在每个生长点细胞内有很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形液泡。如果观察已分化长大的细胞，可看到较大的液泡，数目少，有时只有 1 个巨大浅红色的液泡。

2. 观察洋葱鳞茎表皮细胞的液泡

撕取洋葱鳞茎表皮细胞，放入载玻片中央的 1/3000 中性红染色液中，染色 5~10 min。吸去中性红染液，换上 Ringer 溶液，盖上盖片观察。

（二） 植物细胞线粒体 Jamis green B 活体染色及观察

用镶子撕下洋葱鳞茎表皮一小块，放在 1/5000 Janus green B 染液中染色，一般需 30 min。将染色好的材料移至载玻片的中央（整体染色的根尖撕下一表皮），滴一点 Ringer 溶液，盖上盖玻片，即可观察。在显微镜下观察可见洋葱鳞茎表皮细胞中央被一巨大液泡所占据，细胞核被挤至旁边，细胞质中线粒体被染成蓝绿色，呈颗粒状或线条状。

(三) 植物细胞的细胞核染色及观察

用镣子撕下洋葱鳞茎表皮一小块，在 4% 的多聚甲醛溶液中固定 1 h。将固定后的材料移至小皿中，用 PBS 清洗 3 次，每次 5 min，然后将材料移到载玻片的中央，滴一点 DAPI 染色液，盖上盖玻片，即可观察。在显微镜下观察可见洋葱鳞茎表皮细胞的细胞核被染成蓝色，呈球状。