植物叶绿素荧光参数的测定

植物叶绿素荧光参数的测定是掌握便携式叶绿素荧光仪测定叶绿素荧光的基本原理和方法；理解叶绿素荧光参数的生理学意义及其在植物光合生理、逆境生理等研究中的应用。

植物叶绿素荧光参数的测定的基本原理是光合作用的能量转换主要是指（光系统 Ⅰ 和 Ⅱ）反应中心的电荷分离过程，也就是特殊的叶绿素分子（P700 或 P680）将电子传给电子受体的过程。目前已证明活体叶绿素荧 光主要与光系统 Ⅱ 有关（图 19-1）。植物吸收的光能，主要分为 3 个部分：光化学作用（photo-chemistry ，P）、叶绿素荧光（fluorescence，F）和热耗散（heat dissipation，D），它们之间存在如下关系：

P + F + D = 1

叶绿素荧光分析技术通过测量叶绿素荧光量准确获得光合作用量及相关的植物生长潜能数据。叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作用。与“表观性”的气体交换指标相比。叶绿素荧光参数更具有反映“内在性”特点。本实验以调制式叶绿素荧光仪 PAM（WALZ）为例测定植物叶绿素荧光主要参数。

随着光化学光强的升高，光化学的量子产率 P 逐渐下降，而耗散的量子产量 D 却逐渐升高。这就引起了荧光产量 F 的复杂变化。荧光研究的重要突破就是用一种饱和脉冲使光系统 II 暂时达到饱和（P = 0）。植物叶片的生长状况不同、所处的位置不同、光照不同，叶绿素荧光参数数值也会有所不同，所以不同叶片之间叶绿素荧光产量存在着一定的差异。

材料：植物叶片。

器材：PAM2100 叶绿素荧光仪。

植物叶绿素荧光参数的测定的基本过程可分为如下几步：

（一）仪器使用步骤

1. 仪器安装连接：将光纤和主控单元和叶夹相连接。光纤的一端必须通过位于前面板的三孔光纤连接器连接到主控单元光纤的另一端固定到叶夹 B 上。同时叶夹 B 还应通过 LEAF CLIP 插孔连接到主控单元。

2. 开机：按“POWER ON”键打开内置电脑后绿色指示灯开始闪烁说明仪器工作正常。随后在主控单元的显示器中会显示 PAM。

3. PAM 主控单元：PAM 主控单元上有按键，现分别简要介绍主要按键的功能。

Esc：退出菜单或报告文件；

Edit：打开报告文件；

Pulse：打开停止固定时间间隔的饱和脉冲；

Fm：叶片暗适应后打开饱和脉冲测量 F_o、F_m 和 F_v/F_m；

Menu：打开动力学窗口的主菜单；

Shift：该键只有和其他键结合时才能起作用；

+：增加选定区的数值（参数）设置；

-：减少选定区的数值（参数）设置；

Store：存储记录的动力学曲线；

Com：打开命令菜单；

◀：指针左移；

▶：指针右移；

▲：指针上移；

▼：指针下移；

Act：打开光化光；

Yield：打开一个饱和脉冲以测定照光状态的光系统 H 有效量子产量 F/F'_m。

4. 测量：

（1）通过选择合适的测量光强、增益和样品与光纤的距离来调节 F。在 200~400 mV。同时为了避免人为误差，建议通过检查饱和脉冲时得到的荧光动力学变化曲线来设置合理的饱和脉冲强度和持续时间。通过按 Com 菜单的 Pulse kinetics 功能来实现。

（2）F_o、F_m 和 F_v/F_m 的获得：可以通过按“shift return”键调出菜单执行 Fo determina-tion 来测定 F。也可以通过按外接键盘的键来测量 F_o。可以通过按“Fm”键或按外接键盘的 “M”键来测量 F_m，F_v/F_m 也会自动获得。

（3）量子产量 Yield 的获得：只需按“Yield”键即可。或者将指针移到“RUN”处激活

5. 数据输出：

（1）将 RS 数据线和 PAM 主控单元连接好。

（2）进入动力学窗口按“Menu”键进入 Data 子菜单选择 TransferFiles 并按回车键。

（3）打开一个窗口选择 RS 数据线的 ComPort,选择并激活 ComPort 后出现另一个窗口，其中展示出了 PAM 中存储的数据文件。双击该文件就可进行传输。

6. 关闭仪器：按“Com”键会出现一个命令选择菜单，按“V” 选择“Quitprogram”并按回车键即可关闭仪器。将光纤和叶夹 B 卸下并整理好，放入荧光仪专用箱子中。

（二）主要荧光参数及其意义

F_o：初始荧光产量（original fluorescence yield），也称基础荧光，是 PSⅡ 反应中心（经过充分暗适应以后）处于完全开放状态时的初始荧光产量。

F_m ：最大荧光产量（maximal fluorescence yield），是 PSⅡ 反应中心完全关闭时的荧光产量。通常叶片经暗适应 20 min 后测得。

F_v = F_m-F_o：可变荧光，反映 PSH 的电子传递最大潜力。经暗适应后测得。

F_v/F_m：暗适应下 PSⅡ 反应中心完全开放时的最大光化学效率，反映 PSⅡ 反应中心最大光能转换效率。

F_v/F_o：代表 PSⅡ 潜在光化学活性，与有活性的反应中心的数量成正比关系。

F_o'：光适应下初始荧光。

F_m'：光适应下最大荧光。

F_v' = F_m'-F_o'：光适应下可变荧光。

F_v'/F_m'：光适应下 PSⅡ 最大光化学效率，它反映有热耗散存在时 PSⅡ 反应中心完全开放时的光化学效率，也称为最大天线转换效率。

F_t（或 F_s）：稳态荧光产量（steady-state fluorescence yield）。

φPSⅡ =（Fm'-F_s）/F_m'：PSⅡ 实际光化学效率，它反映在照光下 PSⅡ 反应中心部分关闭的情况下的实际光化学效率。

qP =（F_m'一 F_s）/（F_m'一 F_o'）：光化学猝灭系数（photochemical quenching），它反映了 PSⅡ 反应中心的开放程度。

1-qP：用来表示 PSⅡ 反应中心的关闭程度。

（三）实验测定内容

1. 叶片 F_o、F_m 和 F_v/F_m 的测定：在校园内选取两个树种成熟叶片测定 F_o、F_m 和 F_v/F_m，试比较不同植物之间的异同。

2. 叶片量子产量 Yield 的测定：在校园内选取实验植物成熟叶片测定 Yield，试比较不同植物之间的异同。

1. 禁止在开机的情况下连接外接电源。

2. 禁止过度弯曲光导纤维。