核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶活性的测定

核酮糖-1，5-二磷酸狡化酶/加氧酶 (Rubisco) 是光合作用的重要调节酶，具有双重作用。一是在 Calvin 循环中催化 CO₂ 的固定，二是能催化将 O₂ 加在核酮糖-1，5-二磷酸上。其活性是反映植物叶片生长状态、发育程度以及光合碳同化能力的重要生理指标。在植物衰老或遭受逆境时，酶活性呈下降趋势。本实验了解其在光合作用中的作用，并熟悉 Rubi-sco 活性测定方法。

核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶活性的测定的基本原理是核酮糖-1，5-二磷酸梭化酶催化 1 分子的核酮糖-1， 5-二磷酸（RuBP） 与 1 分子的 CO₂ 结合，产生 2 分子的 3-磷酸甘油酸 （PGA），PGA 可通过 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛-3-磷酸，并使 NADH 氧化，其反应如下：

由上式可知 1 分子 CO₂ 被固定，就有 2 分子 NADH 被氧化。因此，根据 NADH 氧化的量就可计算核酮糖-1，5-二磷酸梭化酶的活性，而由 340 nm 吸光度的变化可计算 NADH 氧化的量。为了使 NADH 的氧化与 CO₂ 的固定同步，从而需要加入磷酸肌酸（Cr~P）和磷酸肌酸激酶的 ATP 再生系统。

核酮糖-1，5-二磷酸加氧酶催化将 O₂ 加在核酮糖-1，5-二磷酸 （RuBP）的 C-2 位置上，生 成 1 分子的磷酸乙醇酸和 3-磷酸甘油酸。Rubisco 加氧反应是典型的单加氧反应，将 CO₂ 的 2 个氧原子掺入 H₂O 和磷酸乙醇酸中，因而加氧酶的活性可用氧电极法以氧的消耗来确定。另外，RuBP 在有 MS²⁺ 离子参与的酶的加氧反应中首先被烯醇化，这时 RuBP 的 C-2 位置被调整为 1 个负碳离子，当与分子氧反应后形成过氧化离子，然后电子又从氧回到烯醇化的 RuBP 再生成负碳离子并产生单线态氧，而这单线态氧可以利用发光光度计来检测。发光光 度计法测定加氧酶活性比氧电极法灵敏度高 70 倍。但如果要测定 Rubisco 的加氧活性的绝对值，则要用氧电极法先行标定。

材料：菠菜、小麦及水稻等植物叶片。

试剂：

5 mmol・L^-1 NADH；25 mmol・L^-1 RuBP；0.2 mol・L^-1 NaHCO₃。

提取介质：40 mmol・L^-1 Tris-HCl 缓冲液（pH 7. 6），内含 10 mmol・L^-1 MgCl₂ 0.25 mmol・L^-1 EDTA、5 mmol・L^-1 谷胱甘肽。

反应介质：100 mmol・L^-1 Tris-HCl 缓冲液（pH 7. 8），内含 12 mmol・L^-1 MgCl₂ 和 0.4 mmol・L^-1 EDTA-Na₂；160 U・mL^-1 磷酸肌酸激酶溶液；160U・mL^-1 油醛-3-酸脱氢酶溶液；50 mmol・L^-1 ATP；50 mmol・L^-1 磷酸肌酸；160 U・mL^-1 磷酸甘油酸激酶溶液。

提取缓冲液：100 mmol・L^-1 Tris-HCl（pH7.8）；1 mmol・L^-1 EDTA；20 mmol・L^-1 KC1。

重悬缓冲液：25 mmol・L^-1 Tris-HCl（pH7.8）；1 mmol・L^-1 EDTA；5 mmol・L^-1 疏基乙醇；20 mmol・L^-1 KCl。

氧电极法反应液：100 mmol・L^-1 Tris-HCl（pH8.2）；0.4 mmol・L^-1 EDTA ；20 mmol・L^-1 MgCl₂。

发光光度计法反应液：50 mmol・L^-1 Tris-HCl（pH8.0）；1.0 mmol・L^-1 MnCl₂ ； 1.0 mmol・L^-1 NaHCO₃。

亚硫酸钠；0.1 mmol・L^-1 二硫苏糖醇（DTT）；硫酸铉；NaCI；10 mmol・L^-1 RuBP 储存液（pH6.5）。

器材：

① 紫外分光光度计
② 冷冻离心机
③ 组织捣碎机
④ 移液管
⑤ 秒表
⑥ 氧电极测氧装置
⑦ FG-300 型发光光度计

核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶活性的测定的基本过程可分为如下几步：

（一）核酮糖-1，5-二磷酸梭化酶/加氧酶裁化活性的测定

1. 酶粗提液的制备：取新鲜菠菜叶片 10 g，洗净擦干，放匀浆器中，加入 10 mL 预冷的提取介质，高速匀浆 30 s，停 30 s，交替进行 3 次；匀浆经 4 层纱布过滤，滤液于 20 000 g 4 ℃ 下离心 15 min，弃沉淀；上清液即酶粗提液，置 0 ℃ 保存备用。

2. RuBPCase 活力测定：按表 15-1 配制酶反应体系。

3. 将配制好的反应体系摇匀，倒入比色杯内，以蒸憎水为空白，在紫外分光光度计上 340 nm 处反应体系的吸光度作为零点值。将 0. 1 mL RuBP 加入比色杯内，并马上计时，每隔 30 s 测 1 次吸光度，共测 3 min。以零点到第一分钟内吸光度下降的绝对值计算酶活力。

由于酶提取介质中可能存在 PGA，会使酶活力测定产生误差，因此除上述测定外，还需

做一个不加 RuBP 的对照。对照的反应体系与上述酶反应体系完全相同，不同之处只是把酶提取介质放在最后添加，添加后马上测定此反应体系在 340 nm 处的吸光度，并记录前一分钟内吸光度的变化量，计算酶活力时应减去这一变化量。

4. 结果计算

式中：∆A—反应最初 1 min 内 340 nm 处吸光度变化的绝对值（减去对照液最初 1 min 的变化量）；

N一稀释倍数；

6.22—每微摩尔 NADH 在 340 nm 处的吸光系数；

2—表示每固定 1 mol CO₂ 有 2 mol NADH 被氧化；

∆t—测定时间 1 min；

d—比色皿光程，cm。

（二）核酮糖-1，5-二磷酸狡化酶/加氧酶加氧活性的测定

1.Rubisco 的提取及纯化：取 5~7 g 叶片加入 10 mL 预冷到 4 ℃ 的提取缓冲液，匀浆， 15 000 g 离心 10 min，取上清液备用。

将上述得到的粗提液用 40% 饱和度的硫酸铉进行分步沉淀，冷冻离心 20 min（4 ℃， 8 000 g）。然后取上清液，加 70% 的饱和度硫酸铉，冷冻离心 20 min（4 ℃，10 000 g）后取沉淀，用少量重悬缓冲液溶解，再经 Sephadex G-25 脱盐后上 DEAE（DE 52）柱，用含 0.0~0.5 mmol・ml^-1 NaCl 的重悬缓冲液进行梯度洗脱，分步收集 0.20~0.25 mmol・ml^-1 NaCl。70% 硫酸铉沉淀，于一 20 ℃ 保存，待测活性前以 8 mg・ml^-1 溶于重悬缓冲液中备用。

2. 氧电极测定法测定 Rubisco 加氧酶活力：将 2 mL 氧电极法反应液，在大气中搅拌 10 min， 使溶液中的溶解氧与大气平衡。然后把电极放在反应室上，调节测氧仪的灵敏度旋钮，使记录仪至满刻度，再加入 0.1 mL 饱和的亚硫酸钠，除尽水中的氧，指针退回到接近 0 点，根据指针退回的格数和 25 ℃ 水的溶解氧量，就可以计算出每格记录纸所代表的溶氧量。 25 ℃ 时的水溶氧量为 0.26 μmol・mL^-1。每格记录纸代表的溶氧量计算如下：

将 2 mL 空气饱和的溶液加入反应室，加入 0.1 mL 酶液（8 mg・ml^-1），在 25 ℃ 保温 10 min 后，装好电极，记录由 DTT 氧化所消耗氧的空白速度，最后加入 0.01 mL RuBP 储存液开始反应，记录反应速度，反应速度以每分钟多少格子记录纸来表示。加氧酶的活力就可通过以下公式计算：

3. 发光光度计法测定 Rubisco 加氧酶活力：先在比色杯中加入 25 μL RuBP 储存液，放入发光光度计反应暗室中，然后将 1.4 mL 发光光度计法反应液中加有 10 μL 酶液的混合液在 25 ℃ 保温 10 min，然后注入比色杯开始反应，自动记录发光曲线。发光强度以峰高来表示（mm）。

1. 提取Rubisco应在冰浴条件下进行。

2. RuBP很不稳定，特别在碱性环境下，因而应在pH5.0-6.5之间于 - 20 ℃ 保存，最好现配现用。