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酶联免疫吸附法测定植物激素含量

相关实验:酶联免疫吸附法测定植物激素含量

最新修订时间:

简介

植物的生长发育、基因表达以及对环境刺激的反应均受体内激素平衡的制约。但是,由于内源激素含量极低,在实验室中要精确快速测定是比较困难的。植物激素(planl hormone)的免疫法测定极大地促进了植物激素的研究。

本实验的目的是掌握酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定植物激素含量的原理及操作,熟悉酶联免疫检测仪的使用。

原理

1. 在ELISA中,抗原抗体反应的检测依靠酶标记物来实现,常用的酶有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酯酶。酶可直接标记激素分子,称为酶标植物激素,也可标记于第二抗体 (识别抗激素抗体Fc片段的抗体或金黄色葡萄球菌A蛋白),称为酶标二抗。这两类标记物分别用于固相抗体型和固相抗原型ELISA。

(1) 固相抗体型ELISA:将抗激素的单克隆抗体(MAb)与已吸附于固相载体上的兔抗鼠1 g抗体(RAMIG)结合,然后加入激素标准品或待测样品,使其与固相化的MAb结合,再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记激素(酶标激素)。通过测定酶标激素的被结合量,可换算出未知样品中激素的数量。

(2) 固相抗原型ELISA:将“激素-蛋白”复合物(该蛋白应不同于免疫原中的载体蛋白)包被于固相载体,加入待测激素(样品或标准品)和抗IAA多克隆抗体(PAb)反应,进行竞争反应,然后让HRP标记羊抗兔Ig抗体(HRP-GARIG)与结合在固相上的PAb反应,通过测定与固相结合的酶量,换算出未知样品中激素的含量。

材料与仪器

材料:

高等植物、真菌、藻类等组织或器官。

试剂:

(1)洗涤缓冲液:0.01 mol · L-1 pH 7.4 磷酸缓冲液(PBS),内含 0. 055% Tween-20;

(2)RAMIG溶液或“激素-蛋白”复合物;

(3)1% 封闭蛋白(该蛋白应不同于免疫原中的载体蛋白);

(4)抗激素MAb或PAb;

(5)激素标准品母液及参比系列溶液(按双倍或4倍系列稀释);

(6)HRP 标记激素或 HRP-GARIG;

(7)邻苯二胺(OPD)基质液:称取 5 mg OPD溶于 5 mL 0.01 mol · L-1 pH 5.0 的磷酸缓冲液中,用前加入30% BAX 12.5 μL。

器材:酶联免疫检测仪、高速冷冻离心机、恒温箱、连续进样器、涡旋仪

96孔微孔板、离 心管、研钵或匀浆器、试管等。

步骤

酶联免疫吸附法测定植物激素含量的基本过程可分为如下几步:

(一) 固相抗体型ELISA

1. 用方阵法滴定选择各反应物最适工作浓度。

2. 将100 μL RAMIG溶液包被聚苯乙烯反应板微孔4 °C湿盒,12 h

3. 弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗涤3次,甩干。

4. 加入100 μl 抗激素 MAb 溶液,37 °C,70 min。

5. 弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗涤3次,甩干。

6. 各孔内依次加入50 μL待测样液,每个样品3次重复,15~20 °C,20 min

7. 加入50 μL HRP标记激素,37 °C ,60 min。

8. 弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗涤3次,甩干。

9. 加入 100 μL OPD 基质液,37 °C显色 15~20 min,加入 50 μL 3mol · L -1 H2SO4,溶液 终止反应。用酶联免疫检测仪测定490 nm下各孔的A490值,求出每份样品重复孔的平均值。

10. 用激素标准品母液和参比系列溶液.在同一微孔板上同上法操作。

(二) 固相抗原型ELISA

1. 用方阵法滴定选择各反应物最适工作浓度。

2. 将100 "激素-蛋白" 复合物溶液包被于微孔板,37 °C,12 h。

3. 弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗涤3次,甩干。

4. 加入100 μL 1% 封闭蛋白溶液封闭,37 °C,30 min。

5. 弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗涤3次,甩干。

6. 各孔同时加入50 μL样液和50 μL抗激素PAb溶液,以加入正常兔血清溶液的孔(非特异吸附孔)为空白调零,37 °C,60 min。

7. 弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗涤3次,甩干。

8. 加入 100 μL HRP-GARIG 溶液,37 °C,60 min。

9. 弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗涤3次,甩干。

10. 随后的显色、中止与比色程序同上。

11. 用激素标准品母液和参比系列溶液,在同一微孔板上同上法操作。

(三) 结果计算

1. 因相抗体型ELISA。

(1) 以加入激素母液的孔(非特异吸附孔)为空白调零,以加入不含激素的PBS的孔为B0

孔,以加入激素标准参比系列溶液的各孔为 Bi 孔。以标准激素物质的量的常用对数lg n为横坐标(x),对应的 ln [Bj/(Bo - Bj)] 为纵坐标(y),可得一条直线y =a +bx。

(2) 将样品孔的人倾值代入上式,换算出待测样品中激素的物质的量,乘以稀释倍数,除 以样品重量,即为每克样品的激素含量。

2. 固相抗原型ELISA

以加入不含激素的磷酸缓冲液的孔为Bo孔,以加入激素标准参比系列溶液的各孔为Bj孔,标准曲线计算与结果分析同上。

注意事项

1. 注意: 酶联免疫检测仪的原理及使用方法。

2. 必须了解所采用抗体的特异性,未经过严格交叉反应试验的抗体不能用于免疫检测,否则会导致错误的结果。

来源:丁香实验

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