肠道感染病毒标本的采集与处理

胃肠道病毒（enterovirus，EV）首先在人肠道中复制，但很少引起胃肠道症状，临床表现主要为以消化道为原发灶的全身感染。EV感染以隐性感染多见，婴幼儿、免疫力低下的成人易感。尽管同一种EV可引起不同临床表现，而不同EV也可引起相同症状。

但通常来说，特有的临床表现常与特定的肠道病毒感染相关联。例如，急性出血性结膜炎（acute hemorrhagic conjunctivitis，AHC）通常是由柯萨奇病毒A24变种（CV-A24v）或肠道病毒70（EV-D70）引起；急性弛缓性麻痹（acute flaccid paralysis，AFP）通常是由脊髓灰质炎病毒和肠道病毒71（EV-A71）引起。
胃肠道病毒标本采集用于EV核酸检测、病毒分离鉴定的标本主要为患者的粪便、咽拭子和疱疹液等临床标本，如患者出现神经系统症状，则应采集脑脊液标本。

急性出血性结膜炎患者应采集结膜拭子或结膜刮取物标本。血清学诊断时，需要采集患者急性期和恢复期的双份血清标本。

器材：
①一次性无菌手套
②采集管

试剂：
①材料：采集标本
②标本缓冲液

肠道感染病毒标本的采集与处理根据样本类型，其基本过程可分为如下几种：

一、肠道感染病毒标本的采集

（1）粪便标本：采集患者发病7日内的粪便标本。粪便标本采集量为5～8 g／份，采集后应立即放入无菌采便管内，4 ℃保存，立即（24小时内）送达实验室，需长期保存的标本应存于-70 ℃冰箱中。

（2）咽拭子标本：采集患者发病3日内的咽拭子标本。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3～5ml保存液的保存管中，保存液配方为91.5 ml Eagle＇s MEM 中加入青霉素和链霉素（终浓度为：青霉素100 U／ml，链霉素为100 μg／ml）、胎牛血清（终浓度为2％ ）、3.5 ml 7.5％ NaHCO₃、1 mlL-谷氨酰胺溶液、1 ml 1 mol／L的HEPES溶液。在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防标本干燥。4 ℃保存，立即（12小时内）送达实验室，-20 ℃以下低温冷冻保存，需长期保存的标本应存于-70 ℃冰箱中。

（3）血清标本：采集急性期血清（发病0～7天）检测相应EV-IgM抗体可用于早期临床诊断，采集急性期（发病0～7天）和恢复期（发病14～30天）双份配对血清检测IgG或中和抗体，可用于回顾性诊断。静脉采集3～5 ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于-20 ℃以下冰箱中冷冻保存。

（4）疱疹液：采集急性期疱疹液时，应先用75％的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破，用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3～5 ml病毒保存液的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4 ℃保存，立即（12小时内）送达实验室，-20 ℃以下低温冷冻保存，需长期保存的标本应存于-70 ℃冰箱中。

（5）脑脊液标本：脑脊液可用于抗体检测、核酸检测或病毒分离。出现神经系统症状的病例，应采集脑脊液标本；采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为1.0～2.0 ml。标本采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4 ℃保存，立即（12小时内）送达实验室，需长期保存的标本应存于-80 ℃冰箱中。

（6）患者眼结膜拭子或结膜刮取物标本：对于急性出血性结膜炎患者，患者眼结膜拭子或结膜刮取物是核酸检测或病毒分离CV-A24v、EV-D70的主要标本。标本应在起病1～3天内采集。用灭菌棉拭子涂擦翻转的上、下睑结膜并拭取泪液后，应立即投入装有病毒保存液标本采集管中，贴好标签，置冰壶内携至实验室或低温（-70 ℃以下）冻存。

二、肠道感染病毒标本的处理

（1）粪便标本：由于粪便标本成分较为复杂，含有的细菌、真菌、毒素等成分可干扰后续的EV病毒分离培养以及EV核酸直接检测。粪便标本应事先用三氯甲烷进行处理，然后用于EV的病原学检测。三氯甲烷处理过程可灭活有包膜的微生物（细菌、真菌、含包膜病毒等），以及大部分脂溶性毒素，并充分分散聚集成团的EV。

操作过程及步骤：

①在生物安全柜中，取约2 g粪便标本、10 ml含有抗生素的完全PBS（含钙、镁离子的磷酸缓冲液）、1 ml三氯甲烷加入50 ml耐三氯甲烷的离心管中。②使用机械振荡器剧烈振荡20分钟，制成粪便悬液。③使用低温挎篮式离心机（bucket centrifuger），4 ℃条件下，1500 g离心力，水平离心20分钟。离心后，包含有脂溶性毒素以及有包膜微生物的三氯甲烷位于底层，EV则位于上层的PBS中。④在生物安全柜中将含有EV的上清转移至无菌的外螺旋冻存管中，以备后续检测。

肛拭子的处理可参考粪便。

（2）咽拭子标本：咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动，洗下拭子上黏附的病毒及含有病毒的细胞等。然后，在4 ℃条件下，10000 r／min离心20分钟，上清用于后续病原学检测。病毒分离培养过程中，如果接种细胞后发现有细菌污染，则应使用0.45 μm无菌滤器对原始标本进行过滤以去除细菌。其他呼吸道标本处理可参考咽拭子。

（3）其他标本：脑脊液、疱疹液、心包液标本4 ℃条件下离心去除杂质和细菌后，可直接用于后续检测。结膜拭子的处理可参考咽拭子。

（1）用于采集的咽拭子标本必须置于适当的病毒保存液中，以防病毒干燥和灭活。
（2）用于核酸检测和病毒分离的标本，应在患者发病后尽早采集，尽快检测；不能立即检测的标本应冷冻保存。
（3）对用于血清学诊断的急性期血清应该在患者发病后尽早采集，恢复期血清则应在患者发病2周后采集。
（4）临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融，如果不能确保-20 ℃的条件，应该在0～8 ℃运输和保存。
（5）标本运输时要附有必要的信息，如标本编号、患者发病日期和标本采集日期。