可调孔玻璃的固定化实验

可调孔玻璃（CPG，Bioran）有多微孔的结构，是一种特殊的有较大表面的烧结玻璃，现在已经被用于直接的酶固定的活化型。这个实验使用 46 nm 孔宽的可调孔玻璃和甘油，通过一个硅氧烷桥结合到玻璃的表面。甘油被偏高砩酸盐氧化产生乙醛玻璃（图 1）。由亚苯基二胺形成希夫碱，并通过减少硼氢化钠来稳定结合。在亚硝酸存在的时候末端氨基被转化为重盐阳离子。蛋白质通过酪氨酰残基固定到重氮基上。

图 1　固定化酶可调孔板玻璃。Ⅰ通过过碘氧化甘油形成乙醛玻璃，由一个硅氧烷桥固定到玻璃的表面；Ⅱ由亚苯基二胺形成希夫碱；Ⅲ减少希夫碱；Ⅳ末端氨基被转化为重盐阳离子；Ⅴ通过酪酰胺残基酶被固定

酶溶液
NaIO4 NaBH4 对亚苯基二胺 磷酸钾
可调孔玻璃

1. CPG 珠子的活化

CPG 珠子（1 g）放入一个 100 ml 的圆底长颈瓶中，并向瓶中加入 70 ml 溶有 91 mg NaIO₄ 的水溶液。长颈瓶在旋转蒸发器上 0.3～0.4 bar（1 bar＝105 Pa）的压力下旋转 1 h。用 350 ml 的水将产生的乙醛玻璃冲洗几次，随后将 77 mg 对亚苯基二胺溶于 70 ml 水中加入其中，将混合液在 0.3～0.4 bar 下旋转。在 20 min 后添加 7 mg NaBH₄，60 min 后用 20 ml 的水剧烈冲洗玻璃珠 3 次。88 ml 2 mol/L HCl 添加到玻璃珠中，长颈瓶在冰浴中旋转，使其温度保持在 0℃。20 min 内，将 1.12 g 的 NaNO₂ 慢慢地添加一部分，在其间长颈瓶在非真空状态下一直转动。在添加了最后一部分之后，长颈瓶必须用一个弱的喷水式真空推进器旋转 10 min（大约 20 mbar），用于排出含氮气体。产生的重氮基玻璃用 20 ml 的冰水冲洗 3 次，之后必须马上用于固定。在用于固定之前的这段时间必须保存于 4℃。

2. 酶的固定

酶溶液（10 mg 溶于 10 ml 的 0～1 mol/L pH 7.5 磷酸钾）被添加到 25 ml 装有玻璃珠子的长颈锥形瓶中，长颈瓶在 4℃ 缓慢旋转过夜（12～16 h）。其后玻璃珠子用 5 ml 0.1mol/L pH 7.5 的磷酸钾溶液冲洗 3 次。浮在表面的缓冲溶液被收集，用来决定未被固定的蛋白质和酶的活性，用这种方法来评估固定的效率。