基因表达系列分析实验（SAGE）
最新修订时间：
原理
材料与仪器
感兴趣的细胞或组织
糖原 EDTA 缓冲液 SDS BSA Tween 20 连接子 T4 DNA 连接酶 BsmFI PC8 SeeDNA 乙酸钠 乙醇 DMSO PCR引物 乙酸铵 DNA ladder 聚丙烯酰胺 TBE凝胶 DNA参照 pZErO-1 质粒 TE缓冲 SOC培养液 Tris · Cl
微量离心管 水浴锅 带冷冻的热控制 循环仪 96 孔 PCR 板 干冰 甲醇浴 台式离心机 平台型摇床 UV 盒 滤镜Spin-X 离心过滤管 微电击杯 Bio-Rad 基因脉冲电转装置 培养管
步骤
实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」
1. 刮取细胞时准备 Dynabeads ，洗涤缓冲液和 5×第一链缓冲液混合液（置于冰上）。
2. 充分悬起 Dynabeads oligo （dT）25，转移 100 ul 到一个无 RNase 的硅烷化微量离心管里，置于磁座上。30 s 后去除上清，不要扰动磁珠。
3. 轻弹或轻轻涡旋把磁珠重悬于 500 ul 裂解/结合缓冲液中。把磁珠留在缓冲液里直到准备把它加到细胞裂解液里。加到细胞裂解液里前移出磁珠。
4. 在一个 2 ml 的微量离心管里用 1ml 的裂解/结合缓冲液裂解 100 000 ～ 1000 000 个细胞（或 2～10 mg的组织），用组织匀浆器匀浆 1 min。如果有必要的话，最高速离心 1 min 去除细胞残渣。使用匀浆器前，彻底清洗，再用 100％ 的乙醇淋洗，用 1L 的 DEPC 处理的双蒸水洗涤。
5. 立刻用一个 1 ml 的注射器使裂解液通过一个 23-G 的针头撕裂基因组 DNA 。把洗过的磁珠和裂解液混合，室温用手连续晃动温育 3～5 min。
6. 把管子放到磁座上 2 min，弃掉上清（上清可以保存用作 DNA 的实验）。
7. 用一个 P200 带滤芯的吸头上下吹吸洗涤磁珠。按下面的顺序洗涤：
7.1 1 ml 含20 ug/ml 糖原的洗涤缓冲液 A（1 ml 洗涤缓冲液中加入 1 ug 20 mg/ml 的糖原），两次。
7.2 1 ml 含20 ug/ml 的糖原的洗涤缓冲液 B， —次。
7.3 200 ul 1× 第一链缓冲液混合液（用 DEPC 水从试剂盒中的 5× 第一链缓冲液混合液稀释），4次。
8. 把磁珠重悬于下面的第一链合成混合液里：
54 ul DEPC ddH2O
18 ul 5× 第一链缓冲液
9 ul 0.1 mol/L DTT
4.5 ul 10 mmol/L dNTP
把管子置于 37°C 2 min， 然后加入 3 ul 200 U/ul SuperScript II 逆转录酶。37°C 温育 1 h， 每 10 min 用手混匀磁珠。把管子置于冰上中止反应。
9. 在冰上往第一链的反应里加入如下第二链合成的成分，次序如下：
227 ul ddH2O， 预冷
150 ul 5× 第二链缓冲液
15 ul 10 mmol/L dNTP
3 ul 10 U/ul E.coli DNA 连接酶
12 ul 10 U/ul E.coli DNA 聚合酶 I
3 ul2 U/ul E.coli RNase H
16°C 温育 2 h， 每 10 min 用手混匀磁珠。
10. 温育后，把管子置于冰上加入 100 ml 0.2 mol/L EDTA 中止反应。
11. 用含 0.1％ SDS 和 2× 乙酰化 的 BSA 的 1×BW 缓冲液洗一次（ 如果不加 BSA ，珠子会变得很黏）。
12. 用 500 ul 含 2×BSA 的 1XBW 缓冲液洗 3 次。重悬在 500 ul 含 2×BSA 的 1×BW 缓冲液中，70°C 加热 20 min 失活 Poll 的核酸酶活力。
13. 用 500 ul 含 2×BSA 的 1×BW 缓冲液洗 3 次。然后用 200 含 2×BSA 的 1×NEB 缓冲液4 （随 NlaⅢ 提供）洗 2 次（第一次用 NEB 缓冲液/ BSA 洗完后转移到一个新管里）。取 5 ul 最后的磁珠悬液，用已知存在于所要建库 cDNA 中的基因引物，PCR 检查 cDNA 的完整性
14. 把磁珠重悬于下面的混合液中：
171 ul LoTE 缓冲液
4 ul 100×BSA
420 ul 10×NEB 缓冲液 4
5 ul NlaⅢ
37°C 温育 1 h。
15. 温育后，把管子置于磁座上约 30 S，然后用下面的溶液和 P200 带滤芯的吸头上下吹吸几次洗涤：
500 ul 含 1％ Tween 20 和 2×BSA 的 1×BW 缓冲液，2 次
500 ul 含 2×BSA 的 1×BW 缓冲液，4 次
200 ul 1×T4 DNA 连接酶缓冲液，2 次
最后重悬于连接酶缓冲液后，每个样品转移 100 ul 到 2 个新的硅烷化的微量离心管里。
16. 移弃最后的洗涤液，珠子重悬在下面的溶液里：
5 ul LoTE 缓冲液（两管）
2 ul 5×T4 DNA 连接酶缓冲液（两管）
3 ul 2 ng/ul 连接子 1A，B （已复性的；管 1）
3 ul 2 ng/ul 连接子 2A，B （已复性的；管 2）
17. 50°C 加热管子 2 min 后置于室温 5～10 min。每管中加入 1 ul 5 U/ul 高浓度 T4 DNA 连接酶，16°C 温育 2 h。间歇混匀。
18. 连接后，置于磁座上约 30 s，然后每个样品用 500 ul 含 0.1 ％ SDS 和 2×乙酰化的 BSA 的 1×BW 缓冲液洗两次（第一次洗后合并管 1 和管 2，以减少后续步骤的损失）。
19. 用 500 ul 含 2×BSA 的 1×BW 缓冲液洗 4 次 ； 用 200 ul 含 2×BSA 的 1×NEB 缓冲液 4 洗两次（第一次用 NEB 缓冲液/BSA 洗后，转移到一个新的管里）。
20. 65°C 预热下面的混合液 2，重悬起磁珠：
170 ul LoTE 缓冲液
4 ul 100×BSA
20 ul 10×NEB 缓冲液 4
2 ul BsmIII
65℃ 温育 1 h，间歇混匀。
21. 温育后，最高速离心 2 min， 然后转移上清到一个新的 1.5 ml 的微量离心管。用 40 ul LoTE 缓冲液洗一次，最后终体积为 240 ml。
22. 用 240 ul PC8 抽提，用 4 ul SeeDNA 乙醇沉淀：
22.1 加入 4 ul SeeDNA ［或 4 ul 3：1 （V/V） 的糖原和 SeeDNA 混合物］
22.2 加入 0.1 倍体积 3 mol/L 乙酸钠（24 ul）， 混匀
22.3 加入 2 倍体积的 100％ 乙醇（480 ul）， 混匀
22.4 室温温育 2 min
22.5 最高速离心 5 min
22.6 70％ 的乙醇洗两次，最后一次洗完后再离心一次，用吸头小心地移出并弃去残余液体，重悬于 10 ul LoTE 缓冲液。
23. 加入下面的混合液：
30. 5 ul ddH2O
5 ul 10×Klenow 缓冲液（或 Roche 缓冲液 H）
2.5 ul 10 mmol/L dNTP
1 ul 100×BSA
1 ul Klenow
37°C 温育 30 min 后，加入 190 ul LoTE 缓冲液（240 ul 终体积）。
24. 用等体积（240 ul） 的 PC8 抽提。转移 200 ul 到一个连接酶「＋」的管里，余下的 40 ul 到连接酶「-」的管里。
25. 用 2 ul SeeDNA、0.1 倍体积乙酸钠和 2 倍体积的 100％ 乙醇沉淀。70％ 乙醇洗两次，最后一次洗完后再离心一次，用吸头小心移去残余液体，晾干 5~10 min。重 悬于 2 ul LoTE 缓冲液。
26. 准备 2× 连接酶「＋」混合液：
2.5 ul 3 mmol/L Tris·Cl， pH 7.5
3.0 ul 5×T4 DNA 连接酶缓冲液
2.0 ul 5 U/ul 的高浓度 T4 DNA 连接酶
准备 2×连接酶「-」混合液：4.5 ul 3 mmol/L Tris ·Cl， pH 7.5 和 3.0 ul 5× T4 DNA 连接酶缓冲液。加入 2 ul 合适的混合液到＋/- 连接酶样品里，在热循环仪上 16°C 过夜（8～12 h）。
27. 连接后，加入 98 ul LoTE 缓冲液，优化 PCR 条件，然后进行大规模的 PCR 扩增。
28. 准备大规模 PCR 的反应混合液（2～3 个 96 孔板，每孔 50 ul 反应液），每个反应的成分如下：
5 ul 10×SAGE PCR 扩增缓冲液
3 ul DMSO
4.0～10 ul 10 mmol/L dNTP
1 ul 350 ng/ul PCR 引物 1
1 ul 350 ng/ul PCR 引物 2
用 ddH2O 调整体积到 49 ul
0.7 ul 5 U/ul Platinum Taq DNA 聚合酶
每孔分装入 49 ul 反应混合液，然后加入 1 ul 适当稀释的模板。
29. 热循环仪运行如下程序：
1 轮：
2 min 94°C
26～32 轮：
30 s 94°C（变性）
1 min 55°C（复性）
1 min 70°C（延伸）
1 轮：
5 min 70°C（终产物延伸）
连接酶「-」的样品应当扩增 35 轮。
不要对 Platinum Taq DNA 聚合酶使用传统的热启动 PCR。
30. 把 PCR 反应物混合到一个 50 ml 的锥形管里，用 LoTE 缓冲液扩大体积到 11.5 ml， 然后用等体积的 PC8 抽提。
31. 乙醇沉淀：
11.5 ml 样品
10 ul SeeDNA
100 ul 糖原
5.1 ml 7.5 mol/L 乙酸铵
38.3 ml 100％ 乙醇
干冰/甲醇浴 15 min。然后室温溶化 2 min。
32. 轻轻涡旋混匀，台式离心机的吊桶转子室温约 3000 g （4000 r/min） 离心 30 min。
33. 用 5 ml 70％ 的乙醇祸旋，洗漆，吊桶转子约 3000 g 室温离心 5 min。
34. 沉淀重悬于 216 ul LoTE 缓冲液。加入 54 ul 5× 上样缓冲液（终体积 270 ul）。
35. 3 个 20％ 聚丙烯酰胺/TBE 凝胶，每孔上样 10 ul。在 27 个泳道用加长的吸头上样，每个加 10 ul （不要过载）。每块凝胶加 10 ul 20 bp 序列阶梯作分子质量参照物。
36. 160 V 电泳 90 min 到距凝胶底约 1 cm，使 103 bp 的双标签片段和 80 bp 的连接子-连接子二者尽可能分开。
37. 在一个用锡箔包好的容器里染凝胶，50 ml TBE 缓冲液中加入 2～5 ul SYBR Green I。让凝胶在水平摇床上浸泡 15 min， 在用 SYBR Green I 或 UV 滤镜的 UV 盒上 观察。
38. 从凝胶上只割出扩增的带双标签的产物，把 3 个割出的凝胶放在硅烷化的 0.5 ml 离心管里（总共 9 个 0.5 ml 的管子），这些管子的底部都有一个直径约 0.5 mm 的 小孔（用 21-G 针头刺的）。
39. 把 0.5 ml 的离心管放在 2.0 ml 的硅烷化的离心管里，最高速离心 4 min （这样可以使聚丙烯酰胺凝胶打碎成小块，收集在 2.0 ml 的管底）。
40. 扔掉 0.5 ml 的离心管。每个 2.0 ml 离心管中加入 250 ul LoTE 缓冲液和 50 ul 7.5 mol/L 的乙酸铵。
41. 涡旋每个管子，然后置 65°C 15 min。在 18 个 Spin-X 离心管的滤膜上各加 5 ul LoTE 缓冲液。
42. 把每个管里的溶液转移到 2 个 Spin-X 的离心管滤膜上（即 9 管转移到 18 个 Spin-X 的离心管滤膜上）。最高速离心 5 min。合并两份洗脱液（总共 300 ul），转移到 1.5 ml 的微量离心管里。有时，纯化的 102 bp 的条带不能被 NlaIII 重新切开，这可能和纯化得不干净有关。如果出现这种问题，把 300 ul 洗脱液通过 Qiaquick 凝胶抽提方案抽提一次，终体积调回到 300 ul。
43. 洗脱液进行乙醇沉淀：
300 ul 样品
0.5 ul SeeDNA
1.5 ul 糖原
133 ul 7.5 mol/L 乙酸铵
1000 ul100％ 乙醇
涡旋，置于干冰/甲醇浴 15 min。室温 2 min 使融化，然后 4°C 离心 15 min。
44. 最高速离心 15 min。75％ 的乙醇洗两次。每管 DNA 重悬于 10 ul LoTE 缓冲液。 混合样品到一个管里（总量 90 ul）。
45. 用 NlaIII 消化 DNA：
90 ul LoTE 缓冲液中的 PCR 产物
226 ul LoTE 缓冲液
440 ul 10×NEB 缓冲液 4
4 ul 100×BSA
40 ul 10 U/ul NlaIII
37°C 温育 1 h。
46. 用等体积的 PC8 抽提。混合水相转移到 1.5 ml 微量离心管。在干冰上乙醇沉淀：
200 ul 样品
66 ul 7.5 mol/L 乙酸铵
3 ul SeeDNA
825 ul 100％ 乙醇
涡旋混匀，置于干冰/甲醇浴 15 min。
47. 室温 2 min 使融化，然后 4°C 离心 15 min。
48. 冷的 75％ 乙醇洗一次，用细头的吸头吸掉残余的乙醇。重悬沉淀于 40 ul LoTE 缓冲液。在冰上加入 5× 上样缓冲液（总共 50 ul）。
49. 把样品加到一个 20％ 聚丙烯酰胺凝胶的 4 个泳道中，隔开一个泳道加上 20 bp 序列阶梯作为分子质量参照物，160 V 电泳 2.5 h。用 1：10 000 的 SYBR Green I 染 15 min。
50. 在长波 UV 照射下切出 24～26 bp 的条带，每两个条带放到一个底部有约 0.5 mm 小洞的 0.5 ml 的微量离心管中（用 21-G 针头刺的）。
51. 把管子放在 2.0 ml 的硅烷化的离心管里，最高速离心 2 min。
52. 扔掉 0.5 ml 的离心管。每个 2.0 ml 离心管中加入 250 ul LoTE 缓冲液和 50 ul 7.5 mol/L 的乙酸铵。涡旋每个管子，然后置于 37°C15 min。不要在 65°C 温育。这会使得 26 bp 片段变性。可以温育更长一点的时间（甚至过夜），但看起来并不会显著提高产量。
53. 用 Spin-X 离心管滤膜按步骤 42 方法分离洗脱液。分在 3 个管里（每个 200 ul ） 进行乙醇沉淀：
200 ul 样品
66 ul 7.5 mol/L 乙酸钱
2 ul SeeDNA
3 ul 糖原
825 ul 100％ 乙醇
置于干冰/甲醇浴 10 min， 然后 4°C 离心 15 min。
54. 用冷的 75％ 乙醇洗两次。每个 DNA 样品重悬于 2.5 ul 冷的 LoTE 缓冲液（总共 7.5 ul）。在加入连接缓冲液前使纯化的双标签片段保持在冰上很重要。高 AT 含量的小片段即使在 LoTE 缓冲液中，室温下也会变性。
55. 混合下面的试剂：
7 ul 混合的双标签 DNA
2 ul 5×连接缓冲液
1ul 5 U/ul高浓度 T4 DNA 连接酶
16°C 温育 1～3 h。
不要连接过夜，因为这样会使得串联产物很长而难于克隆。
56. 连接完成后，加入 2.5 ul 5×上样缓冲液。65°C 加热样品 5 min，立刻置于冰上。
57. 在 10％～12％ 的聚丙烯酰胺/TBE 凝胶上分离串联体。在第一个泳道里加上 1 kb 的分子质量参照物，隔一个泳道把串联的样品全部加到第 3 个孔里。200 V 电泳 45 min。
58. 用 1：10 000 的 SYBR Green I 染 15 min。在 UV 盒上观察，分出感兴趣的区带。
59. 把每一块凝胶放入底部有约 0.5 mm 小洞的 0.5 ml 微量离心管中（用 21-G 针头刺的）。
60. 把 0.5 离心管连同凝胶块放入 2.0 ml 的硅烷化的离心管里，最高速离心 2 min， 把聚丙烯酰胺凝胶打碎成小块，收集在 2.0 ml 的管底。
61. 扔掉 0.5 ml 的离心管。2.0 ml 离心管中加入 300 ul LoTE 缓冲液。涡旋每个管子，然后置于 37°C 15 min。
62. 把每个管里的东西转移到 2 个 Spin-X 的离心管滤膜上（总共 4 个 Spin-X 管子）， 最高速离心 5 min。
63. 每两个 Spin-X 管子的洗脱液合并在一个 1.5 ml 离心管中，加入乙醇进行沉淀：
300 ul 洗脱液
2 ul SeeDNA
133 ul 7.5 mol/L 乙酸铵
1000 ul 100% 的乙醇
64. 最高速离心 15 min。70% 乙醇洗两次，晾干 5 min。纯化的串联 DNA 重悬于 6 ul LoTE 缓冲液。
65. 在10 ul 的体系里，用 SphI 消化 1 ug pZErO-1 质粒：
1 ul pZErO-1 质粒
7 ulddH2O
1 ul 10×NEB 缓冲液 2
1 ul SphI
37°C 温育 15～30 min, 然后 65°C 加热 10 min 灭活。不要消化超过 30 min。
66. 琼脂糖凝胶电泳检查消化是否完全。用 90 ul pH 8.0 的 TE 稀释切好的载体，然后用等体积 PC8 抽提。乙醇沉淀，75% 乙醇洗涤 2 次，重悬于 40 ul 水或 TE 缓冲液中（约 25 ng/ul 载体）。
67. 混合下面的连接反应液，同时配制一份不加串联体的对照反应：
6 ul 纯化的串联体（对照中不加）
1.5 ul dH2O （对照中 7.5 ul）
1 ul 25 ng/ul SphiI 切好的 pZErO 质粒
1 ul 10×T4 DNA 连接酶缓冲液
0.5 ul 4 U/V 的 T4 DNA 连接酶
16°C 温育 2 h。
pZErO质粒的厂商提醒如果温育时间长于 1 h 会使背景增高，原因可能是 ccdB 死亡基因上自然发生的突变。
68. 用 LoTE 缓冲液把样品调整到 200 ul 用等体积的 PC8 抽提，然后乙醇沉淀：
200 ul 样品
133 ul 7.5 mol/L 乙酸铵
2 ul SeeDNA
777 ul 100% 的乙醇
69. 70% 乙醇洗 4 次。最高速快速离心，弃去 70% 乙醇，晾干 5 min。重悬于 10 ul LoTE 缓冲液。
70. 把所需数量的 0.1 mm 的微电击杯和 1.5 ml 的离心管置于冰上。
71. 在合适数量的 15 ml 培养管里加入 1 ml SOC 培养基，置于室温。
72. 往冰上的 1.5 ml 离心管中加入 1 ul 步骤 69 中的 DNA 。在一个标有「对照」的管 里加入 1 ul 0. 01 ng/ul 的 pUC19 对照DNA，用作转化效率的测定。余下的 DNA 保存在 -20°C。
73. 从 -70°C 移出 DH10B 电转感受态细胞，置于冰水上，当细胞融化后，轻弹管子混匀细胞。
74. 每个冷的含 DNA 1.5 ml 的离心管里加入 40 ul 感受态细胞。未使用的细胞用干冰/甲醇重新冻起来，然后放回 -70°C。
75. 把 40 ul 细胞/ DNA 混合物加入到一个预冷的一次性微电击杯中。用 Bio-Rad 基因脉冲电转仪在 100 Ω/25 uF/1.8 kV 的条件下进行电转。
76. 把电转过的细胞转移到一个 15 ml 的培养管里，马上加入 1 ml 室温的 SOC 培养基。37°C，225 r/ min 摇动 15 min。
作者发现涂板前先培养 15 min, 能使转化效率达到 1.0×1010 cfu/ug pUC19。
77. 1 : 100 稀释用 pUC19 电转的对照细胞，取 100 ul 涂在含 100 ug/ml 氨苄青霉素的 LB 平板上。
78. 每个 10 cm 的含 zeocin 的低盐 LB 平板上涂 1/10 转化的细菌。培养 12～16 h 后分析。如果插入片段大小合适的话，每个串联反应的 10 个平板都要保存，以备以后测序。
79. 用 50 ul 的 PCR 反应检查插入片段的大小。配制反应混合液（下面的体积乘以总样品个数加上 1 或 2 以防吸量损失）：
2. 5ul 10×SAGE PCR 扩增缓冲液
1.25 ul DMSO
1.25 ul 10 mmol/L dNTP
0.5 ul 350 ng/ul M13 正向引物
0.5 ul 350 ng/ul M13 反向引物
43 ul ddH2O
0.75 ul 10 : 1 U 的 Taq:Pfu DNA 聚合酶
96 孔板的每孔中加入 50 ul 混合液。
80. 用无菌的牙签或吸头轻轻挑起克隆然后把头放入 PCR 混合液里搅动几下。
81. 用热循环仪执行下面的扩增程序：
1 轮：
2 min 95°C
25 轮：
30 s 94°C （变性）
1 min 55°C （复性）
2 min 72°C （延伸）
1 轮：
5 min 70°C （终产物延伸）
基于 Taq DNA 聚合酶的 PCR 扩增，0. 5～1 min/kb 的模板扩增延伸时间就足够了，与此相反，基于 Pfu 的 PCR 扩增，至少 1～2 min/kb 才能达到类似的合成效率。
82. 取 4 ul 在 1.5% 的琼脂糖凝胶上电泳，电压约 150 V。
大规模筛选时，使用多通道移液器和 Owl Centipede 50 孔的水平电泳系统。多通道移液器的吸头 和 Owl Centipede 配备的 50 齿的梳子正好合适（每隔 1 孔）。因此为保持每个 96 孔板的连续的点样顺序，需要另外准备一块装有上样染料的 96 孔板。
83. 用作测序的 2 ul PCR 产物（所需的确切用量取决于测序的方案，并应当优化）用下述方法处理：
0.1 ul 外切核酸酶 I
0.1 ul 虾碱性磷酸酶
1.8 ul 50 mmol/L Tris·Cl，pH 8. 0
加 2 ul 消化混合液到 2 ul DNA 中。
84. 在热循环仪上进行反应，37°C 温育 15 min, 然后 80°C 加热 15 min。加水到 15 ul。直接取 2 ul 稀释的 PCR 产物测序。
85. 从 SAGEnet 下载 SAGE 的分析软件（见因特网资源），按说明分析。
注意事项
常见问题
1. 材料：
感兴趣的细胞或组织
2. 试剂：
含以下成分的 Dynbeads mRNA DIRECT 试剂盒（Dynal Biotech）：
Dynbeads oligo （dT）25
裂解/结合缓冲液
洗涤缓冲液 A
洗涤缓冲液 B
10 mmol/L Tris·Cl 再生缓冲液
储存缓冲液oligo （dT）25
20 mg/ml 糖原，分子生物学级（Roche Diagnostics）
含以下成分的 SuperScript Choice System cDNA 合成试剂盒（Life Technologies）：
5×第一链缓冲液
DEPC 处理的双蒸水（DEPC ddH2O）
0.1 mol/L DTT
10 mmol/L dNTP
200 U/ul SuperScript II 逆转录酶
5×第二链缓冲液
10 U/ul E.coli DNA 连接酶
10 U/V E.coli DNA 聚合酶 I
2 U/ul E.coli RNase H
5× T4 DNA连接酶缓冲液
1 U/ul T4 DNA 连接酶
0.5 mol/L EDTA， pH 8.0
2×BW缓冲液
0.1％ （m/V） SDS
100× 乙酰化的 BSA （New England Biolabs）
NlaⅢ 和 NEB 缓冲液 4 （New England Biolabs），保存在 -80°C
LoTE缓冲液
1％ （V/V）Tween 20
连接子
5 U/ul 高浓度的 T4 DNA 连接酶（Life Technologies）
BsmFI （New England Biolabs）
PC8
SeeDNA （Amersham Pharmacia Biotech）
3 mol/L 乙酸钠
70％ 和 100％ 乙醇
DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段和 10× 缓冲液（Amersham Pharmacia Biotech）
3 mmol/LTris·Cl，pH 7.5
10× SAGE PCR 扩增缓冲液
DMSO （Sigma）
PCR引物
5 U/ul Platinum Taq DNA 聚合酶（Life Technologies）
7.5 mol/L 乙酸铵（Sigma）
5× 上样缓冲液
预制的 20％ （m/V）微型聚丙烯酰胺/TBE凝胶（Novex）
20 bp DNA ladder （GenSura）
SYBR Green I （Roche Diagnostics）
10× TBE凝胶电泳缓冲液
Qiaquick凝胶抽提试剂盒（Qiagen； 可选）
10％～12％ 的聚丙烯酰胺/TBE凝胶
1 kb 的DNA参照
pZErO-1 质粒（Invitrogen）
SphI 和 NEB 缓冲液 2 （New England Biolabs）
TE缓冲液，pH 8.0
SOC培养液
0.01 ng/ul pUC19 对照质粒 DNA
DH10B电转感受态细胞，冷冻（LifeTechnologies）
含 100 ug/ml 氨苄抗生素的 LB 平板
10 cm含 zeocin 的低盐 LB 平板
Pfu DNA 聚合酶 I （Stratagene）
外切核酸酶 I （USB）
虾碱性磷酸酶（USB）
50 mmol/L Tris · Cl， pH 8.0
3. 仪器耗材
0.5 ml 和 1.5 ml 无 RNase 的硅烷化的微量离心管（Ambion）
1.5 ml 微量离心管的磁座（Dynal Biotech）
0.5 ml、1.5 ml和 2 ml 微量离心管组织匀浆器（如 Polytron PT1200， Brinkmann Instruments）
16°C 水浴锅（可选）
带冷冻的热控制/循环仪
96 孔 PCR 板
干冰/甲醇浴
带固定转头或吊桶转头的台式离心机
平台型摇床
UV 盒和滤镜
Spin-X 离心过滤管（Costar）
0.1 mm 微电击杯
Bio-Rad 基因脉冲电转装置（或类似的装置）
15 ml 培养管
来源：丁香实验
