梯度平板法

生物的抗药性突变是 DNA 分子的某一特定位置的结构改变所致，与药物的存在无关，某种药物的存在只是作为分离某种抗药性菌株的一种手段，而不是作为引发突变的诱导物，因而在含有一定抑制生长药物浓度的平板上涂布大量的细胞群体，极个别抗性突变的细胞会在平板上长成菌落。将这些菌落挑取纯化，进一步进行抗性试验，就可以得到所需要的抗药性菌株，抗药性突变常用作遗传标记，因而掌握分离抗药性突变株的方法是十分必要的。

为了便于选择适当的药物浓度，分离抗药性突变株常用梯度平板法。本实验拟用梯度平板法分离大肠杆菌抗链霉素突变株。制备梯度平板如图所示。先倒入不含药物的底层培养基，把培养板斜放（图 1，A），凝固后将平板平放，再倒入含有链霉素的上层培养基（图 1，B），这样便可得到链霉素浓度从一边到另一边逐渐降低的梯度平板。在此平板上涂布大量敏感菌（或经诱变处理的菌株），经培养后，在链霉素浓度比较高的部位长出的菌落中可分离到抗链霉素突变株。

图 1　链霉素浓度梯度平板

大肠杆菌
链霉素 LB 液体培养基 10 ml 琼脂培养基试管
1 ml 无菌吸管 盛有 70％ 乙醇的烧杯 玻璃涂棒 水浴锅

1. 接种大肠杆菌于盛有 5 ml 液的试管中，37℃ 振荡培养 24 h。

2. 在热水浴中溶化 LB 琼脂培养基。

3. 倒 10 ml 已溶化的不含药物的 LB 琼脂培养基于一套无菌培养皿中，立即将培养皿一端垫起，使琼脂培养基覆盖整个底部并使培养基表面在垫起的一端刚好达到培养皿的底与边的交界处，让培养基在这一倾斜的位置凝固（图 1，A）。

4. 在已凝固的平板底部离琼脂这一边标上「低」，并放回水平位置，然后再在底层培养基上加入每毫升含有 100 ug 链霉素的 LB 琼脂培养基 10 ml，凝固后，便制得一个链霉素浓度从一端的 0 ug／ml 到另一端的 100 ug／ml 的梯度平板。

5. 用 1 ml 无菌吸管吸取 0.2 ml 大肠杆菌培养液加到梯度平板上，用无菌玻璃涂棒将菌液涂布到整个平板表面。

如果用蘸有乙醇并经火焰灭菌的玻璃涂棒，可在火焰旁或伸进平板，在板盖上稍事冷却，以免烫死细胞。

6. 把平板倒置于 37℃ 培养 48 h。

7. 选择 1～2 个生长在梯度平板中部的单个菌落，用无菌接种环接触单个菌落朝高药物浓度的方向划线。

8. 把平板倒置于 37 ℃ 培养 48 h。