平板计数法

本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。

1. 水样的采取

1.1 自来水

先将自来水龙头用火焰烧灼 3 min 灭菌，再开放水龙头使水流 5 min 后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。

1.2 池水、河水或湖水

应取距水面 10～15 cm 的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。

2. 细菌总数测定

2.1 自来水

2.1.1 用灭菌吸管吸取 1 ml 水样，注入灭菌培养皿中。共做两个平皿。

2.1.2 分别倾注约 15 ml 已溶化并冷却到 45 ℃ 左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。

2.1.3 另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基 15 ml，作空白对照。

2.1.4 培养基凝固后，倒置于 37 ℃ 温箱中，培养 24 h，进行菌落计数。

两个平板的平均菌落数即为 1 ml 水样的细菌总数。

2.2 池水、河水或湖水等

2.2.1 稀释水样

取 3 个灭菌空试管，分别加入 9 ml 灭菌水。取 1 ml 水样注入第一管 9 ml 灭菌水内，摇匀，再自第一管取 1 ml 至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为 10^-1 、10^-2 与 10^-3 。稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在 30～300 个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。一般中等污秽水样，取 10^-1 、10^-2 、 10^-3 三个连续稀释度，污秽严重的取 10^-2 、 10^-3 、10^-4 三个连续稀释度。

2.2.2 自最后三个稀释度的试管中各取 1 ml 稀释水加入空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。

2.2.3 各倾注 15 ml 已溶化并冷却至 45 ℃ 左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即放在桌上摇匀。

2.2.4 凝固后倒置于 37℃ 培养箱中培养 24 h。

3. 菌落计数方法

3.1 先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的培养皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到培养皿的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘 2 以代表全培养皿的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。

3.2 首先选择平均菌落数在 30～300 之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数（见表 1，例 1）。

3.3 若有两个稀释度的平均菌落数均在 30～300 之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于 2，应采取两者的平均数；若大于 2，则取其中较小的菌落总数（见表 1，例 2 及例 3）。

3.4 若所有稀释度的平均菌落数均大于 300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数（见表 1，例 4）。

3.5 若所有稀释度的平均菌落数均小于 30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数（见表 1，例 5）。

3.6 若所有稀释度的平均菌落数均不在 30～300 之间，则以最近 300 或 30 的平均菌落数乘以稀释倍数（见表 1，例 6）。

表 1　计算菌落总数方法举例