虫媒病毒在鸡胚成纤维细胞中的空斑形成单位试验

病毒常杀死被病毒感染的细胞 即产生致细胞病变作用。用只染活细胞（如中性红）或只染死细胞（如台盼兰）的染料对单层细胞染色以检测空斑。也可以使用活性染料溴化二苯基四氮唑(MTT) 进行染色，使用 MTT 的优点是黄色的 MTT 能将活细胞染成深蓝色，由于反差明显，计数时不必去除含酚红的凝胶层，且在感染早期即能观察到开始形成的小空斑，可用于分离被病毒转化或对病毒抵抗的细胞。

(1) 选择经 24h~48 h 培养的 4X10⁶/ ml 鸡胚成纤维细胞若干瓶。

(2) 将细胞瓶按病毒稀释度分组标记，每个稀释度为 2 瓶，对照 2 瓶。

(3) 配制含 2%~5%小牛血清的 0. 5% 水解乳蛋白的 Hanks 稀释液 100ml:0. 2%或 0. 5%Hanks 液 97 ml(也可用 Eagle MEM 或 RPMI 1640 培基），灭活小牛血 2 ml,双抗(10 000U/ml )1ml, 调 pH 至 7. 4~7. 6 。

(4) 在冰浴盘内用稀释液将病毒作一系列 10倍递增稀释。

(5) 用 Hanks 液 (pH 约 7.8) 洗涤细胞层约 1~2 次（轻洗勿使细胞脱落）。

(6) 将每个病毒稀释液接种 2瓶细胞，每瓶（小方瓶）接种 0. 5 ml 病毒（大方瓶接种 1 ml入轻轻摇匀。

(7) 置 37℃ 5%CO₂ 培养箱中吸附 1 h, 中间摇动一次，切勿倒置。

(8) 加含培养基的融化琼脂，每大瓶加 10 ml 每小瓶加 5 ml, 控制温度在 45℃~50℃左右加入，以防凝固。培养基琼脂配制法： 6 ml 灭活小牛血清， 1 ml 双抗 (20 000U/ml), 1 ml 卡那 (20 000U/ml), 90 ml 0. 5% Hanks 液，2~3 ml 7. 5% NaHCO₃, 加入等量 56℃ 融化的 3% Hanks 琼脂液并摇匀。

(9) 冷凝后翻转细胞培养瓶，置 37℃5%C0₂ 培养箱中培养 24 h 。

(10) 每瓶中加入 0.2% 中性红，小瓶 0. 25 ml( 大方瓶加 0. 5ml) 摇匀， 37℃ 5% CO₂ 培养箱中培养 4 h 后，翻转培养瓶继续培养。（注：若需保存空斑时，可在每瓶中加人 3%氯化采 0. 5 ml, 并摄影记录）。

(11)A 组虫媒病毒培养 24 h,B 组虫媒病毒培养 72 h 观察结果。

注意：①各稀释度病毒在稀释时，每个稀释度均应取新吸管将病毒液来回吹打三次（或轻轻振摇混匀），当加至各细胞瓶时应加至无细胞层的瓶壁侧底角，然后倾斜并来回摇动使病毒与整个细胞层均匀接种改）②加中性红时也应倾斜，轻摇，使中性红均匀复染整个琼脂表面，然后将瓶子翻转培养。培养液可用 Eagle 或 RPMI 1640 替代 0. 5%Hanks 液。

1. 对细胞的要求 空斑形成单位试验对细胞的制备要求十分严格，细胞单层一定要均匀，致密尤孔，镜检细胞形态和分裂良好，接种病毒前，要精心挑选合格的细胞瓶或培养板使用。

2. 对病毒的要求 稀释病毒时，考虑到一些病毒对热较敏感，故稀释应在冰浴中进行，避免强光和反复冻融。稀释时不应有泡沫，每一稀释度换 1支新吸管或吸头，接种体积应较少， pH保待在 7. 2~7. 4 。

3. 对培养基的要求 加入琼脂覆盖培养基后，应避光培养，因内含的中性红遇光易分解，其分解产物对细胞有毒性作用，并影响染色效果。中性红与细胞接触后 30 min 左右，在光镜下可见到细胞浆中因摄取中性红而呈淡粉红色，证实细胞有活力。

病毒浓度较高的细胞瓶于培养后可出现病毒空斑融合现象，空斑完全融合者，细胞层不染色面琼脂层着红色，反之，病毒稀释度过低的细胞瓶，由于不含病毒颗粒而无空斑形成，则细胞层一片红染，但琼脂层不着色，根据这一点可将空斑完全融合与未出现空斑区别开来。

4. 对观察计数的要求 必须当空斑数目达到稳定，不再增多时方可计数，否则结果不准确。试验时，培养瓶应翻转培养，以除去水滴在琼脂面流动，避免各个空斑交叉融合，中性红加入时间应在空斑出现前，在暗处培养，以防止染料抑制病毒和破坏细胞。对那些生长较慢的病毒空斑，中性红则不是加在最初的覆盖层里，而是加在经过几天培养后的最后一层覆盖层上，可使培养物维持更久，甚至有的中间还得补加营养琼脂覆盖层 1-2 次。空斑使用的琼脂往往含有少量抑制物而影响空斑的产生，应将琼脂用单蒸水浸泡过夜，再用单蒸水冲洗 2-3 次，而后用去离子水冲洗 1-2 次后，用 Hanks 液配制成 3%浓度，煮沸 1h 除菌备用。有人在试验时补加 25mM 的 MgCl₂ 或 CaCl₂ 及 1 mM 半胱氨酸，可加强肠道病毒形成蚀斑。而 MgCl₂ 的加强作用最强。

病毒的效价或滴度可根据空斑数和标本稀释度直接计算，计算结果以每 ml 病毒样品的空斑形成单位 (PFUs) 表示。其方程式如下：

空斑形成单位 (PEUs/ml) =(X₁+X₂+ …+X_n )·d/（n·v）

这里 X₁、 X₂、 X_n表示同一稀释度不同培养板孔（试验单位）中数得的空斑数； n 表示计数空斑的培养板孔数（试验单位数）； v 表示病毒量 (ml) ;d 表示稀释倍数。

（二）空斑形成单位 (PFUs) 与重复感染数 (M. O. I)

在病毒学试验中，经常用到重复感染数 (Multiplicity of Infection, M. O. I) 。重复感染数(M. O. I) 是指感染一个细胞的病毒颗粒的平均数。

在研究病毒感染细胞的分布规律时，首先了解到一个有趣的现象是：当足够量的活病毒与足够量的活细胞相遇（如相混合）时，病毒感染细胞（包括吸附、进入）的机会既是均等的又是独立的。所谓「独立的」，即指在 1个病毒颗粒感染 1个细胞后，并不影响其它病毒颗粒再继续感染该细胞。显然，病毒感染细胞分布的这一规律是符合泊松分布的。泊松分布是表示在一定条件下，离散、随机、变量的分布情况。如当病毒与细胞相遇后，单个细胞可能会被 0 、 1 、 2 、3 、…… n个病毒颗粒感染。

计算 M.O.I 的公式为 m=-ln P[0]

m 为 M.O.I 的缩写

P[0]= 未感染细胞的比例

In= 自然对数

在大多数病毒感染时，细胞感染情况可分为三种。

未感染的细胞 P[O]=e^-m

由一个病毒颗粒感染的细胞 P[1]=me^-m

被多个病毒颗粒感染的细胞 P[>1]=1 - e^-m(m+1)

从上面的公式可推导出，若 M.O. l=0. 01, 则未感染的细胞比例为 P[O]=e^-m=2. 718^-0.01 =

0. 99=99%, 那么感染细胞的比例为 1% 。同样，若 M.O. l=0.1, 则未感染细胞的比例为 P[O]=

e^-m=2. 718^-0.1=0. 90=90%, 那么感染细胞的比例为 10%, 所以 M.O.I 值越大，则实验细胞被感染的比例越大。