线性化杆状病毒DNA

草地夜蛾（Sf 9）细胞 含目的基因的重组杆状病毒转移质粒 阳性对照载体：pVL 1392 - XylE
ORF 1629 缺失的线性 AcMNPV DNA 转染缓冲液 B 转染缓冲液A 500 mmol／L 儿茶酚／50 mmol／L 硫酸氢钠
含 10％ 胎牛血清（FBS）的 TNM-FH 昆虫培养基 60 mm 组织培养皿 27℃ 加湿培养箱 倒置显微镜 15 ml 锥形离心管 带有 GH-3.7 水平转子的4℃离心机

1. 接种 2 × 10⁶ 细胞于 60 mm 培养皿中，接种 3 个培养皿，在含 10％ FBS 的 TNM- FH 昆虫培养基中培养，27℃ 培养直到细胞贴壁。

细胞在平坦光滑的表面才能贴得更加牢固，这个过程常常需要大约 5 min。如果在此时间后细胞 还没有贴壁，说明细胞状态不好或所用的培养皿不好（如有盖培养皿不能用于组织培养）。

昆虫细胞的状态十分重要，只有能快速分裂的细胞才能使用。

2. 待细胞贴壁后，在离心管中加入 0.5 μg ORF 1629 缺失的线性 AcMNPV DNA 和 2～5 μg 重组杆状病毒转移质粒。轻轻振荡混匀，放置 5 min， 再加入 1 ml 转染缓冲液 B。

3. 制备阳性对照：在离心管中加入 0.5 μg ORF 1629 缺失的线性 AcMNPV DNA 和 2 μg 阳性对照载体 pVL 1392-XylE DNA。轻轻振荡混匀，放置 5 min， 再加入 1 ml 转染缓冲液 B。

4. 第一个培养皿（步骤 1）进行共转染试验，做好记号。吸出旧培养基，加入 1 ml 转染缓冲液 A，必须保证液体全部覆盖细胞。

5. 第二个培养皿（步骤 1）作为阳性对照，做好记号。吸出旧培养基，加入 1 ml 转染缓冲液 A，同步骤 4。

6. 第三个培养皿（步骤 1）作为阴性对照，做好记号。吸出旧培养基，加入 3 ml 新鲜的 TNM-FH/10％ FBS 培养基，不加入任何 DNA。

7. 将 1 ml 步骤 2 制备的溶液（含有目的基因的载体）逐滴加入共转染培养皿中，每加入 3～5 滴，来回地晃动平皿，混合液滴。

在此过程中，可能会形成磷酸钙/DNA 沉淀，这种沉淀对于转染是有利的，它是以乳白状形式出现的。

8. 将 1 ml 步骤 3 制备的溶液（含有阳性载体）逐滴加入阳性对照培养皿中，同步骤 7。

9. 将此三块板放入 27℃ 培养箱中培养 4 h。

钙沉淀的暴露时间对于获得良好的转染结果十分重要。如果培养的时间太长，细胞的存活率会有很大的下降，对于不同的细胞系，最适培养时间也不同。对于 Sf 9 细胞，最适培养时间是 4 h。

10. 4 h 后，吸出共转染平皿和阳性对照平皿中的培养基（不包括阴性对照平皿）。每个板中加入 3 ml 新鲜的 TNM-FH/10％ FBS 培养基，来回地晃动平皿，再次吸出所有的培养基。每个板中加入 3 ml 新鲜的 TNM-FH/10％ FBS 培养基。27℃ 培养 4～5 天。

没有必要更换阴性对照平皿中的培养基。

11. 4 天后，在倒置显微镜下观察三块平皿中的感染情况，将共转染平皿与阳性对照平皿和阴性对照平皿对比。

被感染的细胞比未被感染的细胞大，细胞核也大。由于从转染后的早期就停止分裂，与没有转染的细胞相比细胞的密度要低很多。而且，转染了的细胞不能很好的贴壁，悬浮在培养基中的细胞占很高的百分比。

12. 5 天后，收集共转染平皿和阳性对照平皿的上清。用噬斑试验确定病毒滴度或用终端稀释试验估计病毒滴度（见病毒储液滴度测定实验）。

13. 裂解转染细胞（对于非分泌型重组蛋白）检测目的蛋白的表达或将上清（对于分泌型重组蛋白）分成多份，进行相应试验。

除非对目的蛋白有灵敏的检测手段，否则在这一步重组蛋白不能被发现。

14. 加入 100 μl 500 mmol/L 儿茶酚/50 mmol/L 硫酸氢钠到阳性对照平皿检测 XylE 蛋白的表达。大约 5 min， 被感染的细胞变成亮黄色。

15. 将转染上清液转入无菌的 15 ml 的离心管中，4℃，1000 g 离心 10 min。将病毒上清液放入新的无菌管中，避光，4℃ 保存。

16. 扩增病毒上清，以获得可用于生产重组蛋白的高滴度病毒储液（见杆状病毒储液制备实验）。

在共转染前，需要制备 ≥ 10 μg 提纯的质粒 DNA。注意质粒要尽可能的干净，使用 不纯的质粒，细胞在转染后可能溶解，导致病毒的滴度很低。转染后 24 h， Sf 细胞的存活率应 > 97％。