差减 cDNA 文库的建立实验

［＋］ 和 ［-］cDNA 文库（ATCC 或 Stratagene）
TE 缓冲液 EcoRI EDTA 蔗糖溶液 琼脂糖凝胶 TBE 缓冲液 乙醇 S1 核酸酶 S1 核酸酶缓冲液 苯酚 氯仿 异丙醇 乙酸钠 AluI RsaI 去离子甲醜胺 SDS 酵母 tRNA 氯仿 异丙醇 磷酸化的 λgt10 连接臂 T4 DNA 连接酶 E.coli C600flA λ 噬菌体包装抽提物 悬浮介质
离心管

实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」

1. 从［+］ 和 ［-］ 的细胞或组织获得 cDNA 文库。

本方案假设［＋］ 和 ［-］ 文库是 λ 噬菌体文库。如果这两种文库的载体都是质粒的话，那么它们都只需要 100 ug。插入片段需琼脂糖凝胶电泳纯化，而不仅仅是蔗糖梯度离心纯化。

2. 使用大规模的 DNA 纯化柱从［＋］和 ［-］ 文库中各纯化＞1 mg 的 DNA。以 1 mg/ml 的浓度重悬于 TE 缓冲液中。

3. 在 1.5 ml 的微量离心管中分别消化两个文库的 DNA 各 1 mg，反应如下（终体积 1.167 ml）：

1 ml 文库 DNA （1 mg）

0.117 ml 10×EcoRI 缓冲液

0.05 ml EcoRI （1000 U）

混匀，37℃ 温育 5 h。加入 40 ul 0.5 mol/L，pH 8.0 的 EDTA，65℃温育 10 min 以停止反应。进行消化的时间里，在 38 ml SW-28 管子里准备 4 个 10％～40％ 的蔗糖梯度溶液。两个管子标记为 ［＋］，两个管子标记为 ［-］。

插入 cDNA 片段中内在的 EcoRI 位点也会被切开。如果存在这种情况的话，通过这一步获得的部分长度的cDNA克隆可以被用来制作从起始 ［＋］ 文库中筛选全长克隆的探针。现在有更新的克隆位点含有如 NotI 位点的载体（如 λZAP），这类载体的出现几乎可以完全克服上述困难。

4. 每个消化产物中加入等体积的 10％ 蔗糖溶液混匀。将 ［＋］ 文库的混匀的消化产物分成两等份，小心地加到两管标有 ［＋］ 的 10％～40％ 蔗糖梯度溶液上。同样，将［-］ 文库的DNA 消化物也加到标有 ［-］的蔗糖梯度溶液上。蔗糖梯度在 20℃ 下，122 000 g （26 000 r/min， SW-28 转子）离心过夜（18～24 h）。

5. 用吸头小心移除管底的 0.2 ml 组分，其余每个组分分别放入标记好的微量离心管中，保存于 4℃。

6. 每隔一个组分取 20 ul， 在用 TBE 缓冲液配制的 1.5％ 的琼脂糖凝凝胶上分析所含的插入 DNA 片段。

7. 每管中加入 0.3 ml TE 缓冲液和 1 ml 95％ 的乙醇，混匀，置于 -20℃ 2 h 或置于干冰上 15 min， 沉淀插入的 DNA 片段。 组分中已含有沉淀 DNA 所需的足够的 NaCl。为了能够沉淀出 DNA，蔗糖梯度组分中的蔗糖必须要稀释。对于低密度组分，常常需要 1～3 倍的稀释。在高密度的组分中要高效回收 DNA ， 需要更高比例的稀释。

8. 将沉淀溶液解冻后，用微量离心管高速离心 15 min 收集 DNA。吸出并保存上清， 一直保留到回收 DNA 被检查确认后方可丢弃。每管加入 0.5 ml 70％ 的乙醇，再次离心，吸出上清，风干沉淀。

9. 重悬、合并来自 ［＋］ 文库的插入 DNA 于 TE 缓冲液中，终浓度为 0.2 mg/ml。 -20℃保存。

10. 重悬、合并来自 ［-］文库来的插入 DNA 于 100 TE 缓冲液中，置于冰上。各单独保存一小份 400 ng 的 ［＋］和 ［-］cDNA， 用作最终文库的评估。 从 1 mg 总的文库 DNA 中，预期可以回收到大于 10～15 的插入 DNA。小份的 ［＋］和 ［-］ DNA 也可以用放射性标记，用作 ［＋］文库的差异筛选探针。

11. 按如下次序混合反应体系（终体积 112 ul）， 去除 ［-］DNA 的 EcoRI 末端。

100 ul ［-］ 插入 DNA （10～15 ug）

11 ul 10 × S1 核酸酶缓冲液

1 ul 1：500 S1 核酸酶（2 U）

涡旋混匀，离心甩至管底，37℃ 温育 30 min。

12. 加入下述试剂以终止反应：

5 ul 0.5 mol/L EDTA， pH 8.0

200 ul TE 缓冲液

300 ul 苯酚/氯仿/异丙醇

涡旋混匀，离心 1 min 分相，转移上层水相到一个新的离心管里。加入 30 ul 3 mol/L， pH 5.2 的乙酸钠，700 ul 乙醇。冷冻，然后按步骤 7、8 离心收集 DNA。沉淀重悬于 100 ul TE 缓冲液中。

13. 用 AluI 和 RsaI 将 S1 核酸酶处理过的 ［-］ 插入 DNA 消化成小片段。按如下次序混合反应体系（终体积 121 ul）：

100 ul ［-］ 插入 DNA （10～15 ug）

12 ul 10×AluI 缓冲液

5 ul AluI（50 U）

4 ul RsaI （60 U）

涡旋混匀，离心甩至管底，37℃ 温育 3 h。加入 5 ml 0.5 mol/L， pH 8.0 的 EDTA， 65℃ 温育 10 min 以停止反应。取出 5 ml 消化产物电泳检验。

14. 加入 200 ul TE 缓冲液和 300 ul 苯酚/氯仿/异丙醇；按步骤 12 抽提，乙醇沉淀。以 1 ug/pl 的浓度重悬于 TE 缓冲液中。

15. 用 2％ 的琼脂糖凝胶（TBE 缓冲液中）电泳检査 步骤 13 中的 5 ul 消化产物，EB 染色。［-］ DNA 的消化片段应当处于 50～200 bp 之间。

16. 用 ［-］DNA 片段杂交 ［＋］ 插入 DNA。在一个 0.4 ml 的微量离心管中加入如下反应体系（终体积 51 ul）

25 ul 去离子甲酰胺（50％ 的最终体积比）

10 ul［-］ DNA 片段（10 ug）

1 ul ［+］ 插入 DNA （0.2 ，ug）

12.5 ul 20×SSC （终浓度为 5×）

0.05 ul 1 mol/L NaPO₄， pH 7.0 （10 mmol/L 终浓度）

0.5 ul 0.1 mol/L， EDTA， pH 8.0 （1 mmol/L 终浓度）

0.5 ul 10％SDS （0.1％ 终浓度）

1.0 ul 10 mg/ml 酵母 tRNA （0.2 mg/ml 终浓度）

涡旋混勻，离心甩至管底，沸水浴变性 5 min。再次轻甩离心管，37℃ 温育 18～24 h。

17. 加入 200 ul TE 缓冲液，将混合物转移到一个 1.5 ml 的微量离心管中。用 250 ul TE缓冲液洗涤杂交管后加入杂交混合物（现在的体积是 500 ul） 加入 500 ul 苯酚/氯仿/异丙醇，涡旋混匀，离心 1 min 分相。

18. 转移上清水相到一个新的离心管里。按上一步用 500 ul 苯酚/氯仿/异丙醇再抽提一次。加入 50 ul 3 mol/L，pH 5.2 的乙酸钠，1 ml 乙醇，按步骤 7、8 沉淀。沉淀重悬于 12 ul TE缓冲液。

19. 连接插入 DNA 和 λgt10（不是 λgt11）噬菌体臂。混合如下反应体系 （终体积 25 ul）：

12 ul 插入 DNA

10 ul λgt10 磷酸化的臂 （10 ug）

2.5 ul 10× 连接缓冲液

0.5 ul T4 DNA 连接酶（200 U）

用吸头上下轻轻吹吸混匀，12～15℃ 温育过夜。

20. 准备一份新鲜的 E.coli C600hflA 的过夜培养液。第二天上午，按照厂家说明，用 8～10 个商品化的 λ 噬菌体包装抽提物包装步骤 19 的连接产物。

这里使用 λgt10 载体是因为当生长在合适的宿主菌中时，它可以对重组子进行选择。10 ug λ 噬菌体载体在摩尔数上大约相当于所加入的 ［＋］ DNA的 EcoRI 末端的摩尔数。必须考虑 ［＋］ DNA 的 EcoRI 末端，即使在变性杂交后只有少部分 ［＋］ 插入 DNA 片段能被克隆。推荐的 10 ug 载体和不少于 8～10 个包装抽提物能确保很好的文库多样性。

21. 包装混合物中加入悬浮介质，一起倒入一个 5 ml 的聚丙烯管里，调整终体积到 2 ml。加入 2 滴氯仿，用手摇晃 3 s，使氯仿沉淀。

22. 按照文库的扩增方案，取 0.2 ml 和 3 ml 新鲜的 C600hfA 菌液混合， 接种于 150 mm 的平板上，总共 10 块。放置于 37℃ 培养过夜。

23. 第二天上午，取一块平板计数噬斑，所得个数乘以 10 得到文库中总得重组子。

24. 用悬浮介质洗脱板上的噬菌体或直接跳出单个噬斑筛选。

25. 评估新建的差减文库。

最好的办法是扩增文库，差异筛选两块从单个长有 20 000～40 000 个重组子的 150 mm 平板上来的尼龙膜。一块和总的 ［＋］cDNA 探针杂交，另一块和总的 ［-］cDNA 探针杂交。总的［＋］ 和［-］cDNA 探针是放射性标记的第 10 步中保存的 ［＋］和［-］cDNA。大多数克隆应当能 和［＋］ 探针杂交，而几乎没有能和［-］探针杂交。用一种蛋白探针如 actin 或 tubulin 进行杂交是不合适的，根据多种因素推测，结果是没有杂交发生（或只有很少）。

1. 材料

［＋］ 和 ［-］cDNA 文库（ATCC 或 Stratagene）

2. 试剂

TE 缓冲液

EcoRI 和 10×Ec0RI 缓冲液

0.5 mol/L EDTA， pH 8.0

10%（m/V）蔗糖溶液

1.5％ 和 2％ 琼脂糖凝胶

TBE 缓冲液

95％ 和70％ 乙醇

S1 核酸酶（Sigma）

10×S1 核酸酶缓冲液

25 ：24： 1（V/V/V）苯酚/氯仿/异丙醇 3 mol/L 乙酸钠，pH 5.2

AluI 和 10×AluI 缓冲液

RsaI

去离子甲醜胺（Fluka，IBI 或 American Bioanalytical）

20×SSC

1 mol/L NaPO₄，pH 7.0

10％ （m/V） SDS

10 mg/ml 酵母 tRNA

24 ： 1 （V/V）氯仿/异丙醇

磷酸化的 λgt10 连接臂（Stratagene）

10×T4 DNA 连接酶缓冲液

T4 DNA 连接酶（以黏性末端单位计；New England Biolabs）

E.coli C600flA

λ 噬菌体包装抽提物（Stratagene）

悬浮介质（SM）

3. 耗材

SW-28 转子和 38 ml 离心管（Beckman）或其他类似的管子

0.4 ml 微量离心管