用梯度盐析的方法组装高浓度的单核小体实验
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材料与仪器
Tr1s·Cl DTT EDTA KCl 苄脒 高盐缓冲液 低盐缓冲液 无盐缓冲液
兔子泵(Rainin) MWCO 透析管 电导计
步骤
1. 准备如下的重组混合液(最后加入组蛋白):
0.7 mg/ml DNA 片段
20 mmol/L Tr1s·Cl, pH 7.7 (1 mol/L 储液)
10 mmol/L DTT (1 mol/L 储液)
1 mmol/L EDTA, pH 8.0 (0.5 mol/L 储液)
2 mol/L KCl (2.5 mol/L 储液)
0.5 mmol/L 苄脒(0.5 mol/L 储液)
0.63 mg/ml 组蛋白。
混匀后,4℃ 组装 30 min。
2. 装好「兔子」泵装置,将流动速度设定为 205~210 ul/min (图 1)。
图1 梯度盐透析的组装[改自文献(Lugeretal,1999)]
3. 将反应混合液加入 6000~8000 MWCO 透析管中。
4. 将膜放入盛有高盐缓冲液的烧杯的中央,打开泵,4℃ 运行约 50 h。
5. 每隔 5 h 测定烧杯中溶液的导电性(约 300 mmol/L 50 h)。
6. 在无盐缓冲液中透析(>3 h)。
7. 0.7% 琼脂糖凝胶电泳或 5% 聚丙烯酰胺 0.5×TBE 凝胶电泳检测组装的情况。
8. 在 10%~30% 甘油梯度上从自由的 DNA 上纯化核小体,100 000 g·离心 18.5 h 左右。得到的片段可于4℃ 保存 2 个月。
来源:丁香实验