用逐步盐透析的方法组装核小体模板实验
最新修订时间:
材料与仪器
NaCl TE 缓冲液
MWCO 透析管
步骤
1. 准备如下的重组混合液:
约 8 ug 未标记的超声破碎的牛胸腺 DNA (作为载体 DNA; 加自 1~2 mg/ml 储液)
200 000~400 000 cpm 单独标记的 DNA
6.4 ug (组蛋白:DNA 为 0.8:1) 或 0.8 ug(组蛋白:DNA 为 1:1) 纯化的天然核心组蛋白(H2A/H2B 和 H3/H4)
160 ul 5 mol/L NaCl (终浓度 2.0 mol/L)
TE 缓冲液,pH 8.0,至 400 ul。
2. 室温 30 min。
3. 将重组混合液加入 6000~8000 MWCO 透析袋中。
4. 在 1 L 含有 1~2 mol/L NaCl 的 TE 缓冲液,pH 8.0 中透析重组混合物,4℃ 透析 2 h。
5. 重组混合液连续在以下新鲜配置的透析缓冲液中进行透析,每次 4℃ 透析 2 h:
TE 缓冲液,pH 8.0, 含有 1.0 mol/L NaCl
TE 缓冲液,pH 8.0,含有 0.8 mol/L NaCl
TE 缓冲液,pH 8.0,含有 0.6 mol/L NaCl
6. 在不含 NaCl 的 TE 缓冲液,pH 8.0 中透析重组混合物,4℃ 过夜。
7. 电泳检测核小体的完整性。
8. 在 10%~30% 甘油梯度上从裸露的 DNA 上纯化组装好的核小体核心,100 000 g 离心 18.5 h。
来源:丁香实验