去 H1 的寡聚核小体的凝胶过滤实验

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精核 微球菌核酸酶
MSB HSB NaCl LSB CaCl2 EGTA 无蔗糖的 HSB SDS 透析缓冲液
匀浆器 冷冻超速离心机 MWCO 透析袋 梯度制备装置（用于离心） 针头 管子

1. 用 40 ml MSB 重悬约 2 ml 精核。4℃，10 000 g 离心 10 min（用 Beckman JA-20 转子 9200 r/min）。

2. 用 4 倍精核颗粒体积的 HSB 溶液重悬核，在杜恩斯匀浆器中用 B 型研磨棒匀浆 40～50 次以释放寡聚核小体片段。

3. 4℃， 10 000 g 离心 20 min，收集上清液。用2 mol/L NaCl 稀释样品并测量 A₂₆₀ 值，计算来自于核的可溶性染色体 DNA 的百分比（通常约 3～4 mg）。

4. 上清液于 4℃ 使用 6～8 kDa MWCO 透析膜对 4L LSB 透析过夜。当收集透析液时， 混匀样品（挤压透析带的两侧）以回收透析过程中沉淀了的聚核小体。

5. 加入 0.1 mol/L CaCl₂ 至终浓度为 3 mmol/L， 37℃ 温育样品 5 min。

6. 加入 50 U/ul 微球菌核酸酶至终浓度为 10 U/ml， 37℃ 温育 5 min。

7. 加入 0.1 体积的 0.5 mol/L EGTA 终止消化。置冰上。

8. 轻轻涡旋振荡，一滴一滴的加入 2 mol/L NaCl 至终浓度为 0.6 mol/L。

9. 灌制 1.6 cm×58 cm Sepharose CL－6B 柱，以 12～24 ml/h 的速度用几倍柱体积的无蔗糖的 HSB 溶液平衡柱。

10. 4℃， 150 000 g 离心多聚核小体片段 30 min （如　Beckman SW55 转子 40 000 r/ min）以去除不溶物。

11. 将上清上柱，以 12 ml/h 的速度进行凝胶过滤，收集 2 ml 流出液。

12. 取少量流出液用 2 mol/L NaCl 稀释 10～40 倍并测量 A₂₆₀ 值，以确定流出液中 DNA 的浓度。

13. 取各流出液（＞0.5 ug）经 0.5％ SDS 和 0.5 mg/ml 蛋白酶 K 于 50℃ 处理 1 h，然后进行非变性的 1.5％ 琼脂糖 TBE 凝胶电泳。并用 0.1 ug/ml 溴化乙锭染色来分析寡聚核小体 DNA 的长度。

溴化乙锭染色的结果将显示出过消化 DNA 的弥散，一条约 150 bp 的 DNA 条带（单核小体），以及大约为 150 bp 加上多个长度约 200 bp 的更长的条带（二聚、三聚、四聚核小体等）。更高聚的成分在柱的空隙中或在梯度的底部。

14. 用 5～20 ul 选择的流出液在 15％ SDS-PAGE 胶上分析四种核心组蛋白（H2A、H2B、H3、H4 的存在及H1 的缺失。凝胶使用考马斯亮蓝染色。核心组蛋白的分子质量为 14.1 kDa （H2A）、13.8 kDa （H2B）、15.3 kDa （H3）、11.3 kDa （H4）。H1（21. 5 kDa）可以从大多数DNA中分离出来，处于梯度的顶端或柱回收样品的最末端。

15. 将流出液分为含有单聚及二聚核小体、短的寡聚核小体（3～6 个）、长的寡聚核小体（＞6个）三个成分库。小心不要混有 DNA 片段＜150 bp （过消化）或含有 H1 的成分。

16. 如果 DNA 浓度较低（＜0.5 mg/ml），将样品放入 6～8 kDa MWCO 透析袋中，周围放置固体蔗糖进行浓缩。当体积减少了 2～4 倍时，用水洗掉蔗糖，将透析袋在新的样品体积处夹紧。

17. 如果不需进行步骤 16，将样品放入 6～8 kDa MWCO 透析袋中，于　4℃ 对 100 体积的透析缓冲液进行透析 4 h 以上。

18. 分装液体，在液氮或干冰上速冻，并且可在 -80℃ 保存两年以上。

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溴化乙锭是致癌剂，要正确操作。

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