人胚胎干细胞向心肌细胞的分化

一、培 养 基 与 试 剂 的 准 备

1.饲养细胞培养基

I M E F 培 养 基

二、hESC 分 化 为 心 肌 细 胞 的 操 作 方 案

据报道，「切割与粘贴」的方法对于保护核型稳定性是最有效的。但是，大多数hESC 细胞系能够适应于大批量的培养方法（胰蛋白酶消化，胶原酶消化），并且它们能培养在小鼠胚胎成纤维细胞或人饲养细胞（例如包皮成纤维细胞）之上。在我们的实验里， hES2 和 hES3 细胞的常规传代，每周进行一次，培养于 M EFs之上。在传代过程中，集落直径通常是0.5〜£ mm, 但是不会发生汇合。

1.用 「切 割 与 粘 贴 」 的 方 法 对 h E S C (h E S 2 和 h E S 3 ) 进 行 传 代

试剂与材料

无菌或无菌制备

□培养于器官培养皿中的 h E S 2 或 h E S 3 细胞

□培养于器官培养皿中的 M E F 饲养层，新 鲜 制 备

□ 标 准 h E S C 培 养 基

□含 C a 2+和 M g 2的 Dulbecco’s P B S (D -P B S )

□中性蛋白酶溶液， 10 m g /m l 溶于标准 h E S C 培养基，新鲜配制，过滤灭菌。

□ 2 个 Petri培养皿， 3. 5c m ，加 入 D -P B S ， 37°C 培养箱内孵育。

□将玻璃针在火焰上加热、拉长 ，断成两段。在传代之前髙压灭菌。

□ 无 菌 滤 器 ， 0. 22um

□ 黄 色 移 液 器 枪 头（10〜200ul)

非无菌

□微量移液器， 100ul

□ 4 X 放大率立体解剖显微镜（如果可能的话，用加热载物台）

步骤

(a) 检查培养物，选择含有未分化hESC集落的培养皿。

(b) 利用玻璃针切割集落（类似切割比萨），选择未 分 化 的 小块，，传人新的培养皿 中（图4.1)去除已分化部分对于长期培养未分化细胞是非常重要的。在立体解剖显微镜下用4 X 放大视野操作是最便利的。

(c) 去除培养基，加 人 0.5m I中性蛋白酶溶液。

(d) 把培养皿放人培养箱大约2 min, 或者有可能的话，将其放在加热的显微镜载物台上。

(e) 从培养箱中将预热的含有D -PB S的培养皿取出。

(f) 从中性蛋白酶处理的培养皿中挑出未分化的集落；使 用 I00ul带有黄枪头的移液器转移集落到第一个含有D -P B S的培养皿内，接着转移到第二盘，这样做的结果就是 用 D -PBS洗了两遍。

(g) 将这些集落均匀地分配到一个新准备的含M EF饲养层的器官培养皿内（见方案 4. 5)，培养皿内含有I m l 标 准 hESC培 养 基（见 4. 3. 2 节），每皿含有大约9 个集落 。不应该将集落的接种过于接近皿的边缘或是一个挨着一个，以便为集落生长提供足够的空间和便于下次传代。

(h)将器官培养皿小心地置于5 % C0 2、 37°C培养箱 中 。

(i) 每天用标准h E S C 培养基换液。

2.与 E N D 2 共 培 养 的 h E S 2 和 h E S 3 向 心 肌 细 胞 的 分 化

试剂与材料

无菌或无菌准备

□用于两块12 孔 hESC-END2 共培养板的起始材料为： 12个器官培养皿，每个含有 9〜10个 集 落（hES2 或 hES3 ) (见方案4. 1)。

□ 12 孔板内有丝裂霉素 C 处理过的END2 细 胞（见方案4. 6)。

□ 无 血 清 hESC培 养 基（见 4. 3. 2. 2 节）。

□ 标 准 hESC培 养 基（见 3. 2. 1 节）。

□ D-PBS

□中性蛋白酶消化液， 10 mg/m l溶于标准hESC培养基，新鲜配制，过滤除菌。

□蓝色移液器枪头（200〜lOOOpl) 。

非无菌

□ I m l 移液器

步骤

(a) 在接种hESC细胞团之前至少I.5 h，用不含F B S 的 hESC培养某_经讨妗裂霉素 C 处理的END2 细胞换液。

(b) 准备用来清洗未分化hESC集落的平皿：

i)在 6 个直径 3. 5 cm 的平皿中加人 D- P B S液。

ii) 将 I m l标 准 hESC培 养 基（即含有FBS) 加入到两个器官培养皿内。

iii) 把所有平皿放置在 37°C 、 5 % C0 2的培养箱内

(c) 将 0.5 m l 中性蛋白酶加入器官培养皿内，将其置于培养箱7 m in, 从 M E F s 中分 离 hESC集落。

(d) 用带有蓝吸头的Im l移液器从1 2 个器官培养皿内收集所有未分化的hESC 集落 ，然后将其放在3 个预先装有D- P B S 的平皿内洗涤。

(e) 把集落转移到 3 个 新 的 含 有 D-P B S 的 平 皿 内（去 除 连 在 集 落 上 的 M E F s 细胞）。

(f)将 这 些 集 落 转 移 到 2 个 含 有 Im l标 准 h E S C 培 养 基 的 器 官 培 养 皿 内

(g) 用 Im l移液器对着平皿底部使劲上下吹吸（根据集落的大小吹吸 2〜3 次），将集 落 分 散 成 小 块（见方 案 4.1)。

(h) 将 hESC 小细胞团转移到 2 个 1 2 孔 盘 内（含 有 汇 合 的 丝 裂 霉 素 C 处理过的END2 细胞）
。
(i) 在 第 5 ， 9， 1 2 天更换培养基。

(j) 在接 种 1 2 天后，用镜检方法评测搏动区域。搏动通常始于第 5〜7 天 ，在 第 12天时达到最强。用 抗『肌 动 蛋 白（1 : 8 0 0 稀释）和 抗 原 肌 球 蛋 白（1 : 4 0 0 稀释）的抗体进行免疫染色，可以显示搏动区域内心肌细胞的数量，通 常 占 2 0 % 〜2 5 % 。作为另外一种选择，蛋 白 质 印 迹 法 也 可 以 用 来 量 化（例 如 ，用 肌 钙 蛋 白 I 抗 体 ； 1 : 100 稀释）。

3. h E S C 来 源 的 心 肌 细 胞 的 分 离

试剂与材料

无菌

□ 共 培 养 皿（见方 案 4. 2)

□ 标 准 hE SC 培 养 基（见 4. 3. 2. 1 节)

□ 分 离 缓 冲 液（见 4. 3. 3 节和表 4. I)
缓 冲 液 1，低 C a 2+

缓 冲 液 2 ，酶缓冲液

缓 冲 液 3 ， K B

□ Petri 培养皿， 3. 5 c m

□ 0. 1 % 明胶包被的盖玻片或平皿

□ 蓝 色 移 液 器 枪 头（200〜IOOOul)

□ 精 细 手 术 剪（例如 ，虹膜切除剪）

非无菌

□石蜡封口膜

□ I m l 移液器

第 4 章人胚胎干细胞向心肌细胞的分化

步骤

(a) 使用剪刀从共培养板内将搏动区域切割分离出来，并用含 有 F B S 的 标 准 h E S C培养基收集切割的组织。

(b) 分离过程需要三种缓冲液（见 4.3.3 节）。开始分离时，使用带蓝色枪头的移液器将切割的组织小块转移到含有缓冲液 1 的平皿中，室温下保持 30 m i n 。

(c) 把细胞团块从缓冲液 1 转移到缓冲液 2 , 在 3 7 。 (：下 孵 育 约 45m i n (在 移 人 C O 2培养箱前，用封口膜封住皿口）。

(d ) 将细胞团从缓冲液 2 转移到缓冲液 3 内，在 无 旋 轴 摇 床（nonpivoting shaker)上 以 100r/m i n 的速度轻缓摇动，室 温 l h 。

(e) 将细胞团从缓冲液3 转 移 到 含 有 2 0 % F B S 的 标 准 h E S C 培养基内，促进其黏附和存活。用 I m l 移液器对着皿底上下吹吸（2〜4 次）打散细胞团。所需的分散程度取决于用心肌细胞所做的不同试验：

i) 向动物体内移植或进行免疫荧光染色，获得细胞团和单细胞的混合物就足以满足试验了。

ii) 电生理试验需要分散的单细胞。

4. 小 鼠 胚 胎 饲 养 细 胞（M E F ) 的 分 离 培 养

试剂与材料

无菌

□ 通 过 检 査 阴 道 栓（= 0 天）记录了孕龄的妊娠小鼠

□ M E F 培 养 基（见 4. 3.1 节）

□冻存培养基：含 有 2 0 % D M S O 的 M E F 培养基

□ PBSA : 不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 D-PBS

□胰蛋白酶 / E D T A : 0 . 0 5 % 胰蛋白酶， 0.5 mmol/L E D T A 溶于不含 Ca2+ 和 M g2+的 Hank’s B S S

□ 离 心 管 ， 15 ml

□ 冷 冻 小 管（冻存管）

□分离器械

□ 注 射 器 ， 18 G 和 21 G 针头

步骤

(a) 无痛处死怀孕 E 13. 5 天的母鼠。

(b) 分离胚胎，用 P B SA 清洗一次：

i) 从小鼠体内取出子宫，分离出各 个 胚 胎 [Freshney， 2005]。

ii) 去除头与内脏器官（肝脏、心脏、肺等）。

iii) 用 P B S A 清洗胚胎两次。

(c) 将胚胎移入直径3 cm 的细菌平皿，每皿放两个胚胎。

(d) 加人少量 PBSA ，用两把交叉的手术刀片将两个胚胎切成细小的小块。

(e) 每个胚胎加人I m l 胰蛋白酶/ED TA。

(f) 室温下放置 IOmin, 同时轻轻摇晃平皿。另 一 种 方 法 是 ，将 胚 胎 于 4°C 放置18 h，而后在37°C 孵育 1 〇 〜20 min; 这 种 可 增 进 产 率 和 活 力 的 方 法 已 经 介 绍 过（见Freshney [2005])。

(g) 先用带有粉红色 18 G 针头的注射器，之后换成绿色 21 G 针头，将经消化的组织分离成单细胞悬液。把细胞悬液转移到试管，每个胚胎加 5 ml M EF 培 养 基（见 4.3.1 节)。

(h) 使大块组织碎片沉降，将上清液转移入干净的离心管， 250 g离心 5 min。

(i) 用 M E F 培养基重悬细胞沉淀，以大约每瓶一个胚胎的量，将混悬液接种于175 cm2 组织培养瓶内。

(j) 培养细胞 24〜48 h，胰蛋白酶消化。

(k) M E F 培养基重悬细胞。

(l) 与冻 存 液 I : 1 混合，分 装 入 冷 冻 小 管（冻存管），每个胚胎装人两个冻存管。

(m) 按 标 准 步 骤 冷 冻（见 Freshney [2 〇〇 5] ，第 2〇章）

□ END2 培 养 基（见 4.3.1.2 节）

□丝裂霉素C 贮存液， 2 mg/ml

□ PBSA

□胰蛋白酶/EDTA

□组织培养瓶， 25 cm2，涂覆〇 .1 % 明 胶（见 4. 3.4 节）。

□组织培养瓶， 175 cm2，涂覆〇 .1 % 明 胶（见 4. 3.4 节）。

□多孔板， 12 孔，涂覆 0 . 1 % 明 胶（见 4. 3.4 节）。

□ 涂 有 0.1 % 明胶的盖玻片放在 12孔板内（见 4. 3. 4 节）。

步驟

(a) 第 1 天（最好是星期一），用 END2 培 养 基 将 END2 细胞接种于一个涂有0.1%明胶的 25 cm2 组织培养瓶（见 4.3.1.2 节）。 END2 细 胞 以 1 : 8 的比例从已汇合的培养瓶中转出。

(b) 第 5 天，将先前的 25 cm2 培养瓶中所有 END2 细胞接种在一个涂有0.1% 明胶的 175 cm2 培养瓶内。

(C) 第 8 天 ， 175 cm2 培养瓶内细胞应该生长到 100 % 汇合，准备用于丝裂霉素 c 处理 ，如 M E F s 所 描 述（见方案4. 5)。

(d) 加 入 丝 裂 霉 素 C ，每 m l 培 养 基 加 2 mg/ml 的储存液 5ul，达到终浓度lOug/ml。

(e) 将培养瓶置于 37°C 培养至少 2% h，最 长 3 h。

(f) 吸出培养基；用 END2 培养基清洗孔一次，再 用 P B SA 清 洗 2 次。

注 意 ：含 有 丝 裂 霉 素 C 的废液具有很高毒性。

(g) 胰蛋白酶消化，细胞计数。

(h) 用 END2 重新悬浮细胞。

(i) 当需要做进一步实验时，在涂有0.1% 明胶的 12孔板或涂有明胶的直径1.5cm盖玻片上以 1.75X l0⁵ m l 的细胞浓度接种细胞