凝胶中蛋白质的洗脱实验

一、通过扩散来洗脱凝胶中的蛋白质

将 SDS 从蛋白质中移除的早期方法由 Weber 和 Kutter(1971) 发表，但当用于微量的蛋白质时，这个方法既麻烦又会造成大部分蛋白质的损失。

这一领域较多的早期方法已经发表（HagerandBurgess,1980)，但却需要重新讨论 (butbearsrevisiting)。基本步骤包括凝胶电泳本身、将目标蛋白质在凝胶中定位、从凝胶中洗脱蛋白质、移除 SDS 及复性蛋白质以进行随后的研究或使用。

1.凝胶的制备和蛋白质的保护

最近似于标准的话，各种凝胶配方中的任意一种均可以使用。其中有一些需要重点考虑的地方。聚丙烯酰胺凝胶的聚合过程涉及自由基的产生以推动聚合反应发生。因此，在灌胶时应该等待至少 12 h 以确保聚合作用完成。由于反应初始会创造出一个氧化环境，你需要采取预防措施来保护蛋白质不被氧化。这很容易完成，可将廉价而分子质量小的，在电泳时跑在大多数蛋白质前面的内部载体蛋白质 (如β乳球蛋白）加入到将要上样的样品中; 这些载体蛋白会消耗掉凝胶中残留的氧化剂。同样还需要在上层液池里的缓冲液中加人阴离子巯基复合物 (我们使用 0.1 mmol/L 巯基乙酸钠），它们会在电泳过程中穿过凝胶，破坏凝胶中任何具有潜在氧化能力的物质和剩余的自由基。半胱氨酸同自由丙烯酰胺反应会产生半胱氨酸-S-丙酰胺，凝胶中若含有巯基也可以减少此反应 (Chiarietal.，1992)。

应该选用只含有十二烷基形式 (C12) 的高质量 SDS，因为不纯的 SDS 可能含有不同量的 C14 或 C16, 它们对蛋白质的结合比 C12 更强，且非常难于去除 (KunitaniandKresin，1989)。

2.蛋白质在凝胶中的定位

凝胶电泳开始后，就需要确定凝胶中的含有目标条带或特定分子质量条带的位置。

当然，如果你不知道你的酶条带的大小，你可以将凝胶切成几部分，将每一部分的蛋白质洗脱出，并对所有部分都进行酶活性分析。起初，我们通过将凝胶浸泡在冷的 0.25mol/L KCl 中 5 min, 再用冷蒸馏水脱色 ih 来确定我们所感兴趣的条带。现在我们知道，你几乎可以用任何方便的方法来对凝胶染色，包括锌-咪唑（CastelIanos-SerraandHardy，2001) 法; 或是使用新的非常敏感的荧光蛋白染料，如 SYPRORuby(详见第 31 章)。甚至你可以使用考马斯亮蓝染料。在—次实例中，我们成功地对经考马斯亮蓝染色、服色、干燥，保存 10 年的条带完成了复性！另外一种方法是在凝胶侧翼泳道上对有颜色的标准分子质量蛋白质 (可从许多公司获得) 进行电泳。这种方法可以指导我们根据分子质量信息将凝胶的特定部位切割出来。

3.通过扩散来洗脱蛋白质

人们常常会忽视这一简单的步骤，该步骤廉价、有效, 并且能够同时处理多个样品。

下述典型的方案是基于 Hager 和 Burgess(1980) 所述方法修改而成。

(1) 用冷的双蒸水冲洗 SDS 凝胶, 冰冷的 0.25mol,7LKCl 和 1 mmol/L DTT 染色 5 min，确定条带位置。用双蒸水冲洗并用冷双蒸水和 Immol/LDTT 脱色 10~60 min。

或者，可以将一个凝胶泳道划分成许多 3~5 mm 长的部分，将每一部分放人试管中, 按上述方法清洗。

(2) 将凝胶薄片碾碎于 ImL 洗脱缓冲液中。最初我们使用一种 3.5 mL 的硅化处理的 Pyrex 玻璃试管（10 mmX75 mm) 和小型 Teflon 研磨棒（Kontes，K886001size19)，但如今采用 0.3 mL 的洗脱缓冲液、1.5 mL 聚丙烯离心管和一次性聚丙烯研磨棒（如 Kontes 捣碎棒，K749521-1500)。洗脱缓冲液为 50 mmol/LpH7.9 Tris、0.1 mmol/LEDTA、Immol/LDTT，0.15mol/L NaCl、25~100ug/mL BSA(可不加) 及 0.1% SDS。

(3)—旦凝胶被碾碎，需将小的凝胶碎片在旋转器中孵育 1~8 h 使其被动扩散。在 Hager 和 BUrgess(1980) 的方法中，洗脱动力学表明 8.75% 聚丙烯酰胺凝胶介质中，36kDa 多肽的洗脱半衰期小于 30 min,150kDa 多肽的洗脱半衰期为 1?I.5 h(完全洗脱分别需要 4 h 和 16~24 h)。

(4) 将混合物在离心机中以最大速率离心 2 min, 使破碎的凝胶沉淀。随后将上清 (蛋白质洗脱液) 转移到干净的微量离心管中。

4.SDS 的移除和來缩

由于洗脱效率在洗脱缓冲液中含有 0.1%SDS 时为最高，所以在洗脱之后必须移除 SDS。丙酮沉淀法是最有效的方法, 不仅移除了 SDS, 而且还浓缩了蛋白质。基于 Hager 和 Burgess(1980) 的典型步骤如下所述。

(1) 将 4 倍体积的冷丙酮 (-20°C) 加入到蛋白质洗脱液中，使样品在干冰-乙醇浴中沉淀 30 min。由于样品会在干冰-乙醇冰浴中冻结，在离心前要把样品短暂地放在冰水浴中解冻。

(2) 离心机中用最大离心速率离心 5 min。移除并丢弃上清液。在采用 0.16 放射性 RNA 聚合酶的测试实验中我们发现，当洗脱缓冲液中的载体 BSA 浓度为 0ug/mL、15/ng/mL 和 100pg/mL 时, 聚合酶相应的回收率为 71%、90% 和 99%(HagerandBurgess,1980)0(3) 测试表明 99.9% 以上的 SDS 留在丙酮上清液中。可以通过使用 ImL 冰冷的 80% 丙酮清洗沉淀，再次离心以清除残余的 SDS。

5.酶活性的恢复

(1) 丙酮沉淀物需干燥 10 min。

(2) 沉淀物在含有 206mol/L 的盐酸胍 (GuHCl) 的稀释缓冲液 [稀释缓冲液为 50 mmol/LTris(pH7~9)、20% 甘油、0.Immol/LEDTA、1 mmol/LDTT、0.15mol/LNaCl、20?100fxg/mLBSA(可不加）和 0.1% SDS 中溶解并变性。溶解作用在室温下 20 min 之内发生。

(3) 通过加入 I.0 mL 稀释缓冲液迅速将溶解的蛋白质稀释 50 倍, 室温下复性 1~12 h。

(4) 通过恰当的分析方法对复性的蛋白质进行分析。

6.目标酶的预实验

对目标酶进行初步实验，观察其在 6mol/L 及稀释后的盐酸胍中否具有复性的能力，以此可测试指定蛋白质的复性能力。如果恢复良好, 再对其在 SDS 洗脱缓冲液中变性，丙酮沉淀，6mol/L 盐酸胍溶解和稀释后的活性恢复进行测试。

7.方法的局限性

尽管扩散洗脱法用途很广, 但并不能适用于所有的酶。如果酶活性是依赖于两个或更多不同大小的多肽，或需要可分离的辅因子, 如亚铁血红素 (在 SDS 凝胶电泳过程中会离开催化蛋白质) 时，该方法无法使用。如果蛋白质具有可能影响再折叠的翻译后修饰，如糖基化或蛋白酶解加工，或存在一些难于改进的必要二硫化物时，该法同样难以使用。

8.众多应用

即使有上述的局限性, 扩散洗脱法已使很多蛋白质成功复性。这包括 DNA 拓扑异构酶、DNA 连接酶、细菌 a 因子 (Haldenwangetal.，1981;Wiggsetal.,1981)、真核转录因子、H-RasGTP 酶、甲基还原酶、着丝粒结合蛋白和蛋白质/RNA 核糖核酸酶的蛋白质组分。该法已经用于细菌、酵母、人、果蝇及许多其他物种的酶类。该法还可用于含有多个相同亚基的酶。如果将适当的凝胶切片混在一起，该法还可用于含有不同亚基的蛋白质。本法已经成功用于含有必需的 S-S 桥的蛋白质。

二、用反相 HPLC 代替 SDS 凝胶电泳法

上述讨论的对 Hager 和 Burgess 方法的巧妙改动已经由 Prokipcak 等（1994) 发表。

他们将 SDS 疑胶和丙酮沉淀法替换成反相高效液相色谱法 (Rp-HPLC) 和冻干法。将蛋白质应用到一台 C4 反相高效液相色谱仪中，以 0%~50% 乙腈/0.1％TFA 的梯度进行洗脱。洗脱后的蛋白质组分经冻干, 在小体积的 6mol/L 盐酸胍中重悬，稀释至再折叠，并进行酶活性分析。

三、电泳洗脱

上述方案详细描述了利用扩散法洗脱凝胶中的蛋白质，许多操作应该完全适用于电泳洗脱。比起扩散法，尽管这些方法会在较短时间内较高效率的完成洗脱，但它们却更加昂贵并难以扩大规模以应用于多个凝胶片。

SchleicherandSchuellElutrap 和 Bio-RadModel422Electroeluter? 是两种应用最广的商业电泳洗脱装置。这两种装置均涉及将含有目标蛋白质条带的凝胶片放入装置，以及通过蛋白质电泳使蛋白质从凝胶片中洗脱出来的步骤，蛋白质通过大孔薄膜或玻璃筛 (frit)，进人带有只允许小分子或小于约 5kDa 的蛋白质通过的小孔薄膜的小室。用移液器将目标蛋白质从小室中吸出并按要求使用。这些商业产品更为详细的使用方法可以从 Harrington(1990) 及 Seelert 和 Krause(2008) 的优秀综述中和公司资料中找到。

另外一种商业方法为 ProteoPLUSelertoeluter。一个小螺帽试管中装入上游和下游蛋白质截留膜, 这些膜在将试管放于电泳时它会允许电流通过。在蛋白质从凝胶片中洗脱出后，可在同一试管里进行透析以供后续使用。该方法应用的一个例子由 Lei 等 (2007) 给出。

Bio-RadWholeGelEluter 的一整块平板凝胶可电转移成 26 个部分。通常一个蛋白质样品上样于一个凝胶宽度的泳道上，进行 SDS 凝胶电泳。Eluter 的 26 个凹槽平行于蛋白质条带。蛋白质转移出凝胶后，进入到凹棺中，并进入收集箱。

另一项近期研究进展包括将一整块平板凝胶的多个单独组分洗脱人多孔板中，以用于蛋白质组学分析 (Antaletal.,2007)。

四、总结

高分辨率凝胶电泳分离的蛋白质条带可以从凝胶中回收并用于大量应用中。通过压碎凝胶，使蛋白质从凝胶中扩散出来以完成从凝胶片中洗脱蛋白质; 或者可给凝胶片加上电场，将洗脱出的蛋白质捕获在合适的膜结合装置上。可以获得亚微克至 100ug 蛋白质，通常会将其复性来获得酶活性。