羟基磷灰石柱用于蛋白质层析实验

一、机制

从 1971 年（Bernardi，1971;Gorbunoff，1990) 就已经幵始定期发表关于 HA 对蛋白质吸附与解吸附的综述。最近的一篇文献 (Kandorietal.，2004) 引用了较早阐述的机制，酸性蛋白质通过 C(钙)-位点结合, 而碱性蛋白质通过 P(磷酸盐)-位点结合。C-位点和 P-位点首先由 Kawasaki 等 (1986) 提出，随后 Gagnon(1996)Xt 其进一步探讨并强调了 C-位点在单克隆抗体纯化中的重要性: 部分单克隆抗体的结合是通过钙配位络合物 (calciumcoordinationcomplexe) 与抗体中的羧基簇（carboxylcluster) 发生作用。HA-蛋白质间的相互作用可简化为下述内容: 氨基可以吸附于 P-位点，但受到 C-位点的排斥; 对于羧基来说，情况相反且更复杂。尽管胺类可以结合于 P-位点，但是其羧基最初是通过静电作用与 C-位点相互吸引的，与 C-位点的结合还涉及比阴离子交换更强的螯合配位键。

例如，Kawasaki(1991) 所述，对于蛋白质和其他溶质与 C-位点的相互作用，磷酰基比羧基更强。

Don 等 (2007) 进一步的研究工作围绕骨-蛋白质间的相互作用展开，目的是研究蛋白质中净电荷为 o 的一 OH 基和一 NH2 基与 HA 表面的机械作用。受控分子动力模拟表明，HA 表面与骨形态形成蛋白（bonemorphogeneticprotein)(用于骨形成的生长因子）的一 0 H 基和_NH2 基通过水桥 (water-bridged)H-键形成强相互作用。Shen 等 (2008) 用纤连蛋白片段（FN-DIlO) 证实了 Don 等的观察结果。上述及一些类似研究均支持 C-位点和 P-位点模型。HA 表面已经分别建议用于组氨酸标记蛋白质 (如六聚组氨酸标记的蛋白质) 的纯化, 以及富含组氨酸的免疫球蛋白 G(IgG) 的纯化 (Ngetal.，2007)。在这种情况下，基于六聚组氨酸标记的和未标记的融合蛋白质的共洗脱，轉-组氨酸的相互作用会显得很轻微。蛋白质吸附机制与 Gorbunoff(1990) 先前所述一致，引入水桥 H-键作用机制是对其进行了改进。

如果上样缓冲液中含有磷酸盐，那么有些蛋白质将不会吸附于 HA。Ferguson 等 (1980) 提出，在这种情况下通常可以使用 Good’s 缓冲液。例如，Schirch 等 (1985) 纯化的大肠杆菌表达的丝氨酸羟甲基转移酶，首先通过阴离子交换获得组分均一的样品，再以 pH7.0,20 mmol/LJV，JV-2-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸 (BES) 作为上样缓冲液平衡 HA 层析柱，继而采用较小的磷酸盐梯度洗脱。

通过逆转 P-位点相互作用、C-位点相互作用的两种形式和/或 H-键，可以实现蛋白质解吸附。线性和分步梯度的磷酸盐缓冲液是最常用的解吸附试剂。另外,Freitag 和 Breier(1995) 提出蛋白质可通过它们所带的净正电荷与 HA 表面所带净负电荷间的静电作用而固定在层析柱中, 但可以向磷酸盐缓冲液中加人阴离子使蛋白质去吸附, 或加人阳离子通过它们所带的净负电荷与 HA 表面的净正电荷相互作用而使那些固定的蛋白质解吸附。Gorbunoff(1984a;l984b) 及 Gorbunoff 和 Timasheff(1984) 发表的一系列文章已经讨论了 Cr、F’ClOr、SCN-和磷酸盐的作用。Schktterer 等 (2006) 采用氟化物离子将前列腺素 D 合酶从陶瓷化 HA 层析柱上解吸附。该酶来自于牛的脑脊髓液, 吸附后，以含有 NaF 的 10 mmol/LpH6.25 的磷酸钠缓冲液进行一系列地解吸附。他们分别以 150~750 mmol/LNaF 和 375~750 mmol/LNaF 作为线性梯度。

解吸附作用也明显受缓冲液 PH 的影响。根据 Ogawa 和 Hiraide(1996) 的研究，在较低的磷酸盐浓度条件下，PH 大于 7.0 时蛋白质的洗脱比 pH 小于 7.0 时更迅速，且 I 型和 n 型多孔陶瓷化 HA 的洗脱顺序是相似的, 但是对于 I 型层析柱，蛋白质解吸附需要更强的磷酸钠缓冲液。与此类似，在 pH 为 5.5~6.8 时，缓冲液的 pH 同样会影响多孔陶瓷化氟磷灰石层析柱蛋白质的解吸附。表 24.1 比较了在上述范围内，采用规格为 I-ICmX15 cm 的 I 型陶瓷化 HA 和陶瓷化氟磷灰石层析柱分离多种蛋白质的洗脱时间。该层析柱采用 pH10、0.2mol/L 磷酸盐缓冲液灌装，再以 pH5.5、pH6.OSpH6.8 的 5 mmol/L 的磷酸钠缓冲液平衡。蛋白质的洗脱顺序并不是仅仅取决于其 PI。根据 Gorbunoff(1984a;1984b) 的观点，某些蛋白质的解吸附还取决于它们的结构及羧基的含量。

二、化学特性

1.HA 表面的阳离子和阴离子修饰

钙离子和镁离子通过形成磷酸盐-Ca 或磷酸盐-Mg 桥而改变 HA 表面, 尽管最初提出是在 20 多年前，但是最近 Gorbunoff(1984a;1984b) 和 Gagnon 等（2009) 才使用 Ca-修饰的陶瓷化 HA 表面对从 Mab 和 Fc 抗体组分中纯化 Fab 进行改进。这些研究表明，在经过 20 个柱体积的较低浓度磷酸盐缓冲液的处理之后，Ca-修饰的陶瓷化 HA 可以恢复天然形式。

如 Krane 和 Glimcher(1962) 所述，HA 同样具有高度的焦磷酸盐（pyrophosphate,PR) 和多聚磷酸盐亲和力。在无水的磷酸二氢钠和憐酸氢二钠中，PH 是一种污染物，而且对于相应的两种钾盐来说或许也是一种污染物。相对于^^八对蛋白质的吸附与解吸附，磷酸盐缓冲液中存在的 PR 既有优点也有缺点。如图 24.i 所示，采用无水的磷酸钠配制的磷酸盐缓冲液对牛血清白蛋白、卵清蛋白、胰凝乳蛋白酶原又和细胞色素 c 进行分离。图 24,2 所示为采用 Na2 HPO347 氏 o 和 NaHJO4 h2o 配制的磷酸钠缓冲液进行上述蛋白质的分离。用于层析柱的憐酸钠缓冲液是采用无水磷酸钠配制的，且进行了 4 个程序的循环以尽量降低 PR 的影响 (图 24.1)。PPi 有助于 ha 对蛋白质的层析分离，尤其是对于一些弱吸附的蛋白质。然而，我们还必须谨慎操作，保证在所有的实验间高阶磷酸盐的水平均保持一致，以避免人为失误。

2. 金属的吸附

多次使用后，金属物质的累积会导致层析柱褪色。褪色原因可见于牙齿研究者对龋齿的研究、医学研究者对骨骼完整性研究和组织液处理人造骨骼或尸体植入 (cadaverimplant) 的研究以及材料科学家对土壤污染物和金属吸附的检测。

依据 Shepard 等 (2000) 的研究，在进行若干个重组蛋白纯化循环后, 陶瓷化 HA 层析柱会发生褪色。其层析工艺中，陶瓷化 HA 柱层析是继阳离子交换和阴离子交换层析之后的第 3 个步层析。他们得出的结论是，使陶瓷化 HA 褪色的金属物质有多种来源: 工艺用设备、试剂、水及发酵营养物。然而，层析柱褪色不会影响它们对于重组蛋白的纯化。

农学家解释为 HA 会优先吸附多价金属（Maetal.，1 即 4)，并且证实 HA 对二价重金属具有高吸附力。在陶瓷化 HA 层析柱褪色的过程中可以观察到很多这种金属物质，尤其是 Fe、Al、Zn 和 Mn。

3.HA 的可溶性

层析过程中会使用大量的缓冲液, 这会使层析柱的顶端产生空隙或者在 HA 中形成通道。HA 的溶解度常量为 2.4XKT59，相当于约 4ppm。磷酸根离子和碱性 pH 抑制 HA 的溶解。然而,HA 可以从非常稀的溶液中吸附蛋白质, 如 Immol/L(pH6.8) 磷酸盐缓冲液，并且可以是无缓冲能力的碱性金属溶液, 通常为 Immol/L 的 NaCl、KCl 或两性离子缓冲液。Schirch 等（W85) 证实某些酸性蛋白质仅在水中被吸附。正如 Scopes(1993) 所解释的，较低的无缓冲载荷条件可降低对 HA 表面 pH 的控制。研究者们 (Schroderetal.，2003) 指出，可以在磷酸盐缓冲液中使用 4-X#氧氮己环丙磺酸 (4-morpholinepropanesulfonicacid，MES) 来保持磷酸盐洗脱，同时还能够维持上样缓冲液和洗脱缓冲液的 pH。然而，即使使用磷酸盐抑制 HA 的溶解，但其溶解性仍是一个危险因素。例如，采用 undefined0 mmol/L、pH6.5 的磷酸钠平衡层析柱，并用平衡缓冲液上样，继而在 20 mmol/L 磷酸钠缓冲液中增加 NaCl 浓度进行连续洗脱。如此不断循环后，层析柱中会形成空隙并且压力增加。这些空隙和产生的压力是由于 HA 受到了化学损伤，这主要是 HA 表面积累的水合氢离子的解离导致的。图 24.3 所示为流出液的 PH 变化以及水合氢离子吸附 (A 和 B) 和解吸附吸附 (C 和 D) 区域。

Harding 等（2005) 认为水合氢离子的吸附与解吸附是 HA 电荷零点（zeropointcharge) 发挥作用。并且研究 (SkartsilaandSpanos,2007) 证明了电荷零点、pH、水合氢离子吸附与解吸附和钙离子含量间的关系。Skartsila 和 Spanos 所测得的电荷零点并不一致，分别为 7.3±0.1 和 6.5±0.2。这些研究同时还解释了输人缓冲液的 pH 与柱后流出液 pH 偏差间的区别。可以如此合理假设: 改变输入缓冲液的 PH 或提高其缓冲能力，能够降低 pH 变化的强度，同时也可能缩短该变化所持续的时间。然而，先前已经提到，当磷酸盐的浓度太髙时，有些蛋白质无法吸附于 HA。如一些工艺开发工程师指出的，在某些情况下，即使 5 mmol/L 的磷酸盐都能够抑制蛋白质的吸附 (McCueetal.，2007)。

选择合适的缓冲液可以有助于保持目标蛋白质的完整性，同时利于其吸附于 HA。这一步骤在平衡时最好已经完成，平衡时应该没有任何的磷酸盐，然后加载缓冲液。但是在经过几个循环后，填充柱便失效了。研究表明，低至 2rmnol/L 的磷酸盐可以延长层析柱的寿命，同时又兼顾目标蛋白质的纯度。磷酸盐与 MES 或与 3-(N-吗啉代）丙磺酸 (MOPS) 及少量的钙离子联合使用，可充分抑制 HA 的溶解。这些工艺开发工程师并没有明确地提到 pH 转换 (McCueetal.，2007)。图 214 所示为采用 MES 缓冲液的优点, 可以将图 24.3 中所观察到的 pH 变化及其持续时间最小化。两种系统缓冲液的含高浓度 NaCl 的洗脱组分中均可以检测到钙离子。对于 0~02mol/L 磷酸钠缓冲液，钙离子浓度为 36ppm; 对于 75 mmol/LMES/0.02mol/L 的憐酸盐缓冲液，耗离子浓度为 5ppm。

三、纯化操作规程的开发

大多数蛋白质能在具有较低离子强度的、浓度低至 I_ol/L 的磷酸盐缓冲液中吸附于 HA。对于已经吸附的蛋白质, 通常采用含有 NaCl 或 KCl(盐）的高浓度磷酸盐洗脱。用其他类型解吸附溶液洗脱蛋白质并不常见。

如果蛋白质样品中含有大量的盐，那么可以对其进行足够地稀释，但磷酸盐的浓度不得低于 Immol/L, 以保证样品能吸附于 HA。如应用其他缓冲液，其浓度应足以控制 pH。首先以线性盐梯度进行洗脱，检测蛋白质是否能够解吸附。若蛋白质仍结合于层析柱，那么可以采用线性磷酸盐梯度作为洗脱液进行重复操作。检测蛋白质的纯度，确定洗脱蛋白质所需盐浓度或磷酸盐浓度，并将其用于纯化方案中的洗脱步骤。比较分步洗脱和梯度洗脱所得蛋白质的纯度。需要时可依此调整纯化方案。如果需要将其他类型的结合蛋白质和生物组分与层析柱解吸附，可以先采用 3 个柱体积的、不含其他盐类的、低离子强度 (LIS) 的磷酸盐进行清洗，再以 3~5 个柱体积的、0.5mol/LpH7 的磷酸盐缓冲液，3 个柱体积的、LIS 缓冲液以及 3~5 个柱体积的 0.5~1mol/LNaOH 进行清洗。准备用于下一轮分离的层析柱时，可以先釆用 3 个柱体积的 LIS 缓冲液，再以 3 个柱体积的、pH 与平衡缓冲液一致的、0.5mol/L 磷酸盐缓冲液清洗层析柱，最后加载 3 个柱体积的上样缓冲液。

四、实验室规模层析柱的填装

实验室规模 HA 层析柱的填装方案因 HA 的来源不同而异。填装 HAUltrogel 吸附剂时采用的层析柱，其髙/径比值为 1~6，直径为 1.6~5.0 cm。准备填装用吸附剂时，应采用温和地翻转容器或者塑料搅拌器搅动的方式。将适当体积的吸附剂浆液倒入真空容器中，且后者的体积应约为目的填装层析柱体积的 2 倍。然后，向其中另外加入约 40% 的水稀释浆液。轻轻混合后, 连接真空泵除去其中未溶解的空气。再缓慢地搅拌已脱气的吸附剂，以获得均匀的悬浮液。再一次性地将其倒人层析柱中，尽量不要使空气进入浆液流中。待悬浮液沉降 5~10 min，直至层析柱顶端出现 Icm 清晰可见的清液层。

再将人口适配器插人层析柱中，并与液相层析设备相连，继而采用水或者平衡缓冲液，以流速为 55~250 cm/h 运行, 具体流速取决于所需填充床的高度; 对于 20 cm 髙的填充床可用 55 cm/h 的流速,5 cm 髙的填充床则用 250 cm/h 的流速。调整人口适配器的位置, 使其接触填充床的表面，进而排除截留的空气。若有空气突然侵入层析柱中，须按照上述步骤重新进行填装。

CHT 是一种球状的多孔陶瓷化介质。可与之相配的层析柱包括带有可变高度适配器的 MilliporeVantageL 和 WatersAP，额定压力在 3bar 以上。可根据填充床的尺寸及 CHT 的密度计算所需 CHT 的重量。例如，一个 I.Icm 内径 X20.0 cm 髙度的填充柱，其体积为 19 mL，需装入 12 gCHT。用塑料搅拌器将 CHT 悬浮于 3.5 倍体积的填充缓冲液 (0.2mol/LNa2P047 H20,pH9~10) 中。选择的填充缓冲液，应至少具有 0.Imol/L 的离子强度并至少含有浓度为 20 mmol/L 的缓冲组分，pH 为 6.8~10。静置悬浮液，使封闭于填料颗粒中的空气分离出来。将填充延长管连接于层析柱，这样便可以一步处理所有悬浮的陶瓷状 HA。向层析柱/延长装置中灌入填装缓冲液, 并使其高度达到 1~2 cm。用塑料搅拌器搅拌烧杯中的填料颗粒使其悬浮，再倒入到层析柱/延长装置中。用填充缓冲液清洗剩余的陶瓷化 HA，再倒人层析柱/延长装置中。打开层析柱的出口，通过重力流动作用填装陶瓷化 HA，直至高度恒定。关闭层析柱的出口，移走延长管, 然后插入入口适配器，使其降低至正好能够接触到重力作用填装的陶瓷化 HA 表面。再将其与液相层析设备相连, 打开层析柱的出口, 用 3 个柱体积的填充缓冲液，以 250 cm/h 的流速平衡填充的陶瓷化 HA。调整适配器的位置，使其刚好可以接触到因上述流动后所产生的陶瓷状 HA 表面。若有空气突然侵人到填充床中，通常可以在层析柱的调节步骤中将其排除。层析柱的调节步骤: 先采用 3 个柱体积的平衡缓冲液, 再以 3 个柱体积的 0.5~Imol/LNaOH、3 个柱体积的 0.4~0.5mol/L 的磷酸钠缓冲液 (pH6.5~7.2) 和 3 个柱体积的平衡缓冲液处理层析柱, 使其适应新的环境。平衡缓冲液一般为离子强度较低的缓冲液，如 2~20 mm0l/L 的磷酸盐，当磷酸盐的浓度为 2~10 mmol/L 时, 需向其中加入 GoocPs 缓冲液。

微晶型 HA 可以从不同的公司购买到。将 Bio~GelHTP 和 HT 填充至层析柱之前，须进行相关的准备工作。缓慢地倾出 HT 的上清液后，加入等体积的填充缓冲液。通过旋转容器悬浮 HT，将 2 倍于所需灌装层析柱体积的悬浮液倒入烧杯中。沉淀悬浮液 30 min，再轻轻倒出上清液，其中可能含有细微颗粒。对于 HTP，每 2.5 mL 目标填装体积对应 Ig 干粉。将粉末放置于烧杯中，容器体积应为目标填装体积的 2~6 倍，并用塑料搅拌棒缓慢将其混合。沉淀悬浮液 30 min，再轻轻倒出上清液，其中可能含有细微颗粒。加人与目标填充体积相当的填充缓冲液，得到 50%(V/V) 悬浮液。用塑料搅拌棒轻轻搅拌以悬浮 HT 或 HTP。以漏斗或层析柱延长装置将所有的悬浮液灌注到层析柱中。10 min 后, 打开层析柱的排出口，通过重力流作用灌装层析柱。不要让空气突然侵人填充床中。当层析柱顶端剩余约 2 cm 缓冲液时，关闭排出口，移走延长管或漏斗, 再插入入口适配器，使其下降以排除其接入通路产生的空气。继续降低适配器的位置，直至其恰好接触到重力形成的填充床表面。若采用 DNAGradeBio-GelHTP，准备工作和填装均与 HTP 相似。HT 和 HTP 的最大流速为 100 cm/h;DNAGradeBio-GelHTP 的最大流速为 40 cm/h。对于 CalbiochemHydroxylapatiteFast；Flow 及其高分辨率层析柱的预处理及填装分别与 HTP 和 DNAGradeBkKielHTP 相似。Clarkson 公司的陶瓷化 HA 与 HypatiteC 的预处理及填装也与 HTP 和 HT 相似。

HA 的供应商通常不会列出全部的 HA 产品目录。表 24.2 所列为 HA 和陶瓷化 HA 目前的一些供应商。

五、生产规模层析柱的填装

对于填充良好的大规模层析柱, 从其顶端到底端，其中的填料是连续均匀分布的，并表现为最佳的层析效能。CHT 的填装方法有数种，如何选择取决于所用的层析柱类型及设备。在填装层析柱前, 应参阅层析柱、介质转移设备和介质填装设备的相关指导手册。

开放性层析柱的最大填充床高度不能高于介质固位板 (釉料或网状物) 表面间距离的 50%，如 EasyPack(BiCrRadLaboratories)、BPG(GEHealthcare) 和 Moduline2(Millipore)。例如，若该距离为 54 cm, 那么最大的填充高度则为 27 cm。同时计算填充柱的体积。每升填充床体积，使用 630 g 干粉及 1.79L 填充缓冲液，以制备成 50%(V/V) 的浆液。关闭层析柱的排出口，导入填充缓冲液，随后加入干粉。用塑料搅拌器搅动 CHT-缓冲液的混合物使干粉水化, 将两者混合形成均质的浆液。再逆向搅拌以尽量减少浆液的移动。根据生产商的说明书安装顶端的适配器，并将其插入至层析柱管体中。5 min 后形成无树脂区, 降低适配器使内部空气可以通过顶端的入口排出，并用填充缓冲液清洗适配器上的流动收集器和入口的线路。填充流速为 200~300 cm/h，并运行 2 个柱体积的填充缓冲液。一旦固定填充床，即可调低适配器，使介质固位板和填充柱顶端留有 1~5 mm 的空间。切记不要将适配器降至填充床中，避免造成 CHT 颗粒的不可逆损伤。

对于封闭型的层析柱，如 InPlace(Bio-RadLaboratories) 和 Bio-ProcessLPLC(GEHealthcare) 层析柱, 应在外部准备浆液, 再进行填装。同开放型层析柱一样，其最大的填充床高度不能髙于介质固位板 (釉料) 表面间距离的 50%。并计算填充柱的体积。

每升填充床体积, 采用 630 g 干粉及 1.79L 填充缓冲液，制备成 50%(V/V) 浆液。将填充缓冲液倒入介质浆液罐中，随后加入干粉。通过剪切力较小的水翼叶轮 (A3 型) 搅动 CHT-缓冲液的混合物, 使干粉水化，并将两者混合形成均质的浆液。再用介质转移装置将全部浆液转移至层析柱中。以 50 cm/h 的流速排除浆液中的气泡。停止运行，静置 5 min 形成无树脂区后，降低适配器使内部空气可以通过顶端的人口排出，并用填充缓冲液清洗适配器上的流动收集器和入口的线路。填充时轴向流速为 200~300 cm/h, 以压缩填充床。继续调低适配器的位置, 直至介质固位板和填充柱顶端间相距 1~5 mm。当填装不锈钢的 InPlace 或 LPLC 层析柱时, 保持轴向流直至适配器达到距目标高度之上的 2 cm 后，降低流速到 10 cm/h，直至适配器的信号传感器与填充床顶端接触。

目前还并没有采用微晶型 HA 填充生产规模层析柱。HAUltrogel 用于大直径的浅层析柱。填装这类层析柱及介质需要得到相应供应商的帮助。

关于填装的生产用层析柱的评价，可根据管理机构的建议进行，这也是终端用户通常需要的。美国食品与药物管理局及欧洲、加拿大、日本和亚洲的相应机构已经发布了评价填装层析柱的指导意见。一些层析介质的供应商也提出了对于实验室规模和生产规模层析柱评价的简单方法, 但是并没有必要将两者的结果相关联。一些生物医药公司的创新者 (TeetersandQuiftones-Garda，2005) 是非常睿智的，他们提出采用停留时间分布 (residencetimedistribution，RTD) 来追踪层析柱使用期限内填装层析柱的状态。

六、应用

在重组蛋白的纯化方案中，采用线性或分步的磷酸盐洗脱仍是占据主导地位的解吸附策略。对于在毕赤酵母中表达的人过氧化氢酶，采用 3 步工艺-硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和 HA 层析，可使其纯度达到 95%。以 0.05~0.3mol/L、PH6.8 的磷酸盐线性梯度，可以将重组的过氧化氢酶从 HA 层析柱上洗脱。Shi 等 (2007) 从培养基中获得分泌的过氧化氢酶，最终得率为 60%。如 Hsieh 等（2003)、St 垃 nsk^等 (2007)、Luellau 等 (1 卯 8) 和 Nuss 等 (2008) 所述, 用 HA 层析柱，并以线性或分步梯度的磷酸盐可以纯化多种蛋白质。

diSalvo 等 (2004) 在大肠杆菌中表达了人源及两种大肠杆菌来源的卩比咳醛激酶 D 先用硫酸铵沉淀含有该酶的细胞裂解物颗粒，再采用磷酸盐缓冲液将其溶解，之后以 3 种类型的层析介质-疏水作用凝胶、阴离子交换树脂和陶瓷化 HA 进行纯化。对于人吡哆醛激酶的 HA 纯化, 采用 20 mmol/LN，iV-2-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸钠（BES)、pH7.3 作为吸附缓冲液, 以线性梯度到 100 mmd/L、pH7.3 的磷酸氢二钾进行洗脱。Stuhlfelder 等 (2002) 用阴离子交换层析、凝胶过滤和陶瓷化 HA 层析进行了番茄 (1^吵^-sz’conescwZe 尬 mot) 细胞培养物的茉莉酸甲基水解酯酶（methyljasmonatehydrolyzingesterase) 的纯化。在 HA 的纯化步骤中，采用 20 mmol/L 的磷酸氢二钾、20 mmol/L 的 p-巯基乙醇和 0.3 mmol/L 的氯化钙，pH6.8 作为吸附缓冲液; 以线性梯度到 500 mmol/L 的磷酸氢二钾、20_0l/L 的卩-巯基乙醇，pH6.8 的缓冲液进行洗脱。在最近的一个实用型专利中，发明者采用多级的层析工艺 (亲和层析、疏水作用层析、HA 层析和阴离子交换层析) 纯化重组红细胞生成素 (recombinanterythropoietin,rEPO)(Schumannetal.,2007): 在采用陶瓷化 HA 纯化步骤中，以 20 mmol/LTris、5 minol/LCaCl2、250 mmol/LNaCl、9% 异丙醇、pH6.9, 作为吸附缓冲液。用 10 mmol/LTris、0.5 mmol/LCaCl2、10 mmol/LK2 HPO4，pH6.8, 作为 rEPO 的洗脱缓冲液。在关于 rEPO 的另一个纯化工艺中, 发明者用 HAUltrogel 吸附剂，以含有 Imol/LNaCl 和 2 mmol/LCaCl2 的 0.05mol/LTris 缓冲液 (pH7.5) 平衡吸附蛋白质。用含 0.005%(OT/V) 聚山梨醇 80 的 20_ol/L 磷酸盐缓冲液 (pH7.5) 洗脱 rEPO。

免疫球蛋白的纯化也可以采用多步骤的层析工艺进行。例如，Leibl 等 (1996) 先后用肝素-亲和层析和陶瓷化 HA 层析, 从人血清的 CohnFrGI 中进一步纯化人免疫球蛋白 A(IgA)。其中陶瓷化 HA 层析步骤，以 10 mmol/L 的磷酸盐、137 mmd/L 的 NaCl，pH7.4 缓冲液平衡, 同时辅以 IgA 肝素组分。再以 15.3 mmol/L 的磷酸盐、287_ol/L 的 NaCUpH6.8 的缓冲液洗脱吸附的 IgA 单体，之后采用阴离子交换、分子筛、亲和层析进一步纯化 IgA, 去除其中的 IgG。在另外一个例子中，采用疏水性电荷诱导层析 (hydrophobicchargeinductionchromatography) 从鼠的腹水中分离单克隆 IgG(Mab)。Guerrier 等 (2001) 用 HAgel 分离 Mab 组分，先以 10 mmol/L、pH8 的磷酸钠平衡，再以 0~5mol/L 的 KCUOmmol/L(pH6.8) 的磷酸钠洗脱。Sinacola 和 Robinson(2002) 将 HA 作为精制步骤，可以从有活性的 scFv 中去除单链抗体 (scFv) 聚集物和无活性的单体 scFv。用 200 mmol/LNaCUmmol/L 乙二胺四乙酸缓冲液和 100 mmol/LTris-HCl，pH8.3 平衡时，有活性的 scFv 不能吸附于 HA。

临床上, 高滴度表达的 Mab 通常含有大量的免疫球蛋白聚集物。在磷酸盐洗脱体系中，HA 表面对单体和多聚体的选择性一般是相同的。可以用 NaCl 从 HA 上面的多聚体中纯化单体（Sun，2003)。详细描述可见美国专利 200501o7594。用 0.5mol/L、pH6.8 的磷酸钠可以去除多聚物、内毒素和 DNA。采用磷酸盐进行洗脱时，Gagnon(2008) 通过向缓冲液中加入 PEG 可使多聚体的去除效果显著地提高。若洗脱液中加入高浓度的 PEG，单体将不会吸附于层析柱, 而多聚体、内毒素和 DNA 仍处于吸附状态。