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    用插入诱变法分离突变体实验

    相关实验：用插入诱变法分离突变体实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    酵母菌株BY4741
    T4 DNA连接酶缓冲液 Taq DNA 聚合酶
    YPD平板 锥形瓶 SC-leu平板 RNase A

    步骤

    第 1 天 把菌株10-1在 YPD平板上划单克隆，于 30°C下培养2 天。 第 3 天 挑取一个单菌落接种到5ml YPD液体培养基中，于 30°C下过夜培养。 第4 天 用血球计数板测定细胞密度（ 附录G，用标准血球计数板进行酵母细胞计数），将 细胞稀释至5X 106 个/m l，按 照 “技术和方案1， 酵母的高效转化”进行高效转化。操 作中微小的改进如下文所述。 收集细胞，用 9鸿 预 先 经 Noi I 消化的mTn3_^CZ/ LEU2 染色体组文库D N A 转 化。得到总共9MgD N A ，总体积为9(^1。每个转化用10M1DNA。做 10个转化，其中 一个不含D N A 作为对照，其 余 9 个 用 l MgD N A 。在 第 16步 ，用 60(^1无菌水重悬细 胞 ，取 20(^1转化液涂布于HC-leu平板上，于 30°C下培养3 天。 转 花I f 株1〇~1 第7 天 统计菌株10-1转化后的Leii+ 菌落的数量。轻轻地将转化子影印到HC-leu平板上， HC-leu平板含有15jug/m l苯菌灵，于 23°C下培养2 天。 第9 天 筛选苯菌灵敏感的突变体。统计转化子中苯菌灵敏感的突变体的比例。从 HC-leu 平板上将苯菌灵敏感的菌落重新克隆到新的HC-leu平板上，于 30°C下培养2 天。 第11天 挑取单菌落，在 5ml YPD液体培养基中于30°C下过夜培养。 第12天 取细胞于HC-leu和 HC-leU+ 苯菌灵平板上划线，重新测试苯菌灵的敏感性，于 23°C下培养3 天。 第1 3 天 按 照 “技术和方案3D，制备酵母基因组DNA: 玻璃珠法”从 6 个培养物中准备基 因组DN A，用 lOO^lT E 重悬最终获得的珠子。每种D N A 取 1 5 4 , 用 5〜101；及似1消
    化 ，总体积为l 〇〇] ul。加 入 l ^gR NaseA，于 37°C下培养几小时。通过加热至65°C ，持 续 20m in使只似1失活。取走10^1，用 1X T 4 D N A 连接酶缓冲液（ 含 ATP) 将溶液稀 释 至 lOOpl。加 人 100U T 4 D N A 连接酶，在室温下过夜培养。 第M 天 通 过 PCR扩增邻近Tn3 转座子的D N A 序列。向 5^1连接后的D N A 溶液中加入： 5^1缺少Mg2+的 10X T 叫聚合酶缓冲液 ljal 25jumol/L 引物 1 ljal 25|umol/L 引物 2 ljul 10m mol/L dNTP 3 2 ^ 蒸馏水 I jlJ T叫 聚 合 酶 （2. 5U ) 利 用 “热启动”规则对分离的基因组D N A 的成功扩增十分重要。我们使用来自 Lum itekk的 “镁热珠” 。这些珠子是含有PCR反应 所 需 的MgCl2的蜡状珠子。每个 PCR反应加人一个蜡状珠子。蜡将会在68°C溶解以释放MgCl2。95°C扩增5mm 后 ，以 下过程循环35次 ： 94〇C lm in 65°C lm in 72〇C 2. 5min0 以 72°C持 续 7mm终止最后一个循环。纯化扩增的D N A 以去除蛋白质、 ^核 苷 酸 链 和 dNTP (在此过程中将提供一个W izardPCR准备试剂盒），使用SEQ引狻对DNA 测序。 • 第1 5 天 统 计 23°C下培养平板上苯菌灵敏感的菌落。使用联网的计算机，提 交 D N A 序列， 与酵母基因组数据库进行比对，检测转座子的定位。 材料

    来源：丁香实验

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