合成致死突变体实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

酵母菌株

步骤

第 i 天 .你将获得两个含有二倍体孢子的Omnitray盘。首先将注意力转向带384孔针接种工具（ pinning tool) 的座板及各清洗座板。每个清洗座板上放有塑料托盘，两个装有 100m l水，一个装有漂白剂，三个装有更多的水。最后一个是装有乙醇的Pyrex碟。把

$工具浸入托盘中，每次冲洗后放置在托盘的盖子上。非常重要的是针要悬浮在水或漂白剂中并且不要碰触到底部。在每个盘子中洗针接种工具lmin。清洗完毕后，在乙醇中浸泡工具并在火焰上烧灼。转动工具180°，浸泡乙醇，再次用火焰烧灼。小心不要烧伤自己。 1 ) 水中 lmin 2 ) 水中 lmin 3 ) 漂白剂中lmin 4 ) 水中 lmin 5 ) 水中 lmin 6 ) 水中 lmin 浸泡乙醇后烧灼一~-转动180°— "-浸泡乙醇后烧灼 TOP \ _____________________________X 拿掉平板盖子，平板如同上图显示放置，有缺角的边缘向下。将拷贝器放置在平板上，并使带有四个洞的针孔指示标记在底部。拷贝器有两面，正确的一面有4 个孔： AB 88 CD 不正确的一面有16个孔：复制器（针接种工具）的指针必须进入C 位置（见上）的两个孔（有一个孔在拷贝器的另一面）。仔细挑取细胞，从原板上拿掉复制器，重新盖上盖子。从待拷贝平板 (SC-his-arg ser+ can+ 2 mmol7 L 3A T + G4 1 8 ) 上移走盖子，放上第二个复制器，按标有 “C”的指示孔的指示针接种细胞。如同上面描述的冲洗过程冲洗针接种工具。放平板在 30°C 。用石蜡膜缠绕包裹 K A c板并在4°C冷藏。第 3 天针接种细胞到 SC-his-arg+ can+ G418 和 SC-his-arg+can + G418 + NAT 板上。如同上面描述的冲洗并灭菌针接种工具。平板在30°C保温。$

第 4 天比较在 S C _ h is -a rg + c a n + G 4 1 8 和 SC-his_arg + c a n 3 A T + G 4 1 8 + N A T 板上菌体的生长。记下能在SC-his-arg + c a n + G 4 1 8 板上生长但不能在SC -his-arg + can + G418 + N A T 板上生长的菌体。它们在板上会有一个位置。如同上面描述的，当观察在板上的标准位置时， 3 8 4 格式板上的排是A 〜 P ，行是 1〜 2 4。因此，菌株的位置是“板、排、行” 。例如，如果你的4 号板上有一个菌体在K 排 4 行上可以在SC -his-arg + can + G 4 1 8 板上生长，但不能在SC -his-arg + c a n + G 4 1 8 + N A T 板上生长，它是合成致死组合（ 4- K - 4 ) 的候选者。查找网址 h ttp ://b u d 0 2 .m ic r. Virginia. ed u :8080/y scg en o m ics•打开链接 “ E U - R O SC A R F Deletion Strains (384-w ell fo rm a t).” 在上面的面板上，搜寻 4 号板 K 排 4 行。答案应该是c id 。第 6 天从冰箱中取出K A c板（第 1 天保存的）。向 96孔微量滴定碟中的每个孔里加入 2 0 0 4 的无菌水。鉴别来自筛选的可能的突变体，并且仔细地重悬1/4的你正检测的孢子细胞到第1、 4、 7 和 1 0 排孔中（由于在后面需要较多的孢子，不要用掉所有的孢子)。对每次培养，取 20p l进行两次10倍稀释。例如，如果你拥有细胞于A-1孔中，就进行逐次10倍稀释到A-2 和 A-3孔中。用石蜡膜封闭K A c板并放回冰箱。从 3 0 his-arg-ser+ can+ cyh, SC-his-arg+ can+ cyhH-G418, 和 SC-his-arg+ can+ cyh+ G418 + N A T 板上获取孢子。第 8 天对平板计分。令人感兴趣的突变体生长在SC-his-arg+ can+ cyh和 SC-his-arg+can + cyh+ G418 板上，但不在 SC-his-arg+ can+ cyh+ G418+N A T 板上。第 1 0 天从冰箱中拿出K A c板（第 1 天保存的）。把孢子加入到20(^1无菌水中并将50M 涂在 SC-his-arg-ser+ can十cyh 板上。第 1 2 天复制平板到 SC -his-arg + c a n + cyh + G 418 平板， S O h is - a r g + c a n + c y h + N A T 平板，和 S C -h is - a r g + c a n + c y h + G 4 1 8 + N A T 平板上。对平板计分并记录数据。第 1 3 天

来源：丁香实验