卵透明带去除和带下注射的方法

卵透明带去除和带下注射的方法

材料

试剂

Acidic Tyrode 溶液

在 80 ml 水中混匀以下物质： 0.8 gNaCi、 0.02 gKCl, 0.024 gCaCl2,2 H20 、0 • Olg MgCl2.6 H2O、 0 • Ig 葡萄糖和 0.4 g polyvinylpyrrolidone (PVP)。调节 pH 到2.5 , 终体积 100 ml。

来源于孕母马血清的促性腺激素 (PMS;25IU/m l 盐溶液 XSigma-Aldrich G 4527)

人绒毛膜促性腺激素（hCG; 25IU/m l 盐溶液）（Sigma-Aldrich G 8554)

透明质酸酶 M2 溶 液（特殊培养基 MR-051-F)

培养基

M2 (特殊培养基 MR-015-D)

M16 (特殊培养基 MR-010-D)

鼠

B6D2F1 雌 性（6〜8 周大； Haarlan)

假孕母鼠，同 步化的（交配后 2.5d [dpc]; 选 择 0.5dpc 进行带下注射）

矿 物 油（ Fischer 0121-1)

用来转基因的病毒（1 〇 ⁹ 个病毒颗粒/ml)

仪器

细胞培养用圆形盖玻片

准备吸液管，在本生灯火焰上轻拉硼硅酸盐玻璃毛细管，直到拉出的吸液管外层直径为80〜120um。用 10ul毛细管微量吸液管来进行这一步操作（VWR 53432〜728)。

准备轻拉硼硅酸盐玻璃毛细管（轻轻在本生灯火焰上）直到尖端内层直径约 200um。用此50ul的微吸液管进行此步操作（VWR 53432〜783)。

孵育，预设为 37°C , 5 % C0 2

倒置显微镜

微型离心机

显微操作设备

Cell-t r a m 油 泵（Eppendorf) 用来调节针的把持

手动的显微操纵器对（L e i t z A C S O l ) 用来持针和注射

微 量 移 液 器（ICSI，无菌的）（M I C -cust-0， I D 4〜5um， O D 5〜6um , bevellength 50°C [8〜9fim] with a spike H u m a g e n , Virginia)

Screw-actuated syringe (S A S 11/2- E [Z M S ] ) 用来操作注射用针针（30 G )

巴斯德吸液管

立视镜

外科仪器：钝 弯 钳（2)、细 点 钳（2)、小剪

方法

准备待收获晶胚的鼠

1.注射 8〜I 2 B6D2F l 雌 鼠（6〜8 周龄， Harrlan) 腹腔注射 5 个单位的 PMS。

2•刚好 48 h 注 射 5 个单位的 h C G 。转移雌鼠到雄鼠的笼中（一只雌鼠一只雄鼠)。

3.进行卵透明带去除或带下注射。

卵透明带去除

a. 注射 h C G 48 h 后 ，无菌条件下手术收集输卵管，转移到一滴 50ul 矿物油覆盖的M 2。插入含一个纯的 30 G 的针的漏斗管，用 M 2 培养基吹出晶胚（2〜4 细胞时期）。 用几个连续的 M 2 液滴用移液管上下吸取 3〜4 次洗晶胚。用 M 16 培养基重复此步。迅速操作，孵育晶胚在 37°C 直到下一操作步骤。

b. 为了去除卵透明带，转移晶胚到一滴酸性的 T y r o d e 溶液中，用移液管上下吸取几次，然后转移到第二滴酸性的 T y r o d e 溶液中。室温孵育直到卵透明带溶解(30s〜I m i n)。用巴斯德移液管在矿物油覆盖的 50ul M2 液滴中洗晶胚两次。在矿物油覆盖的 M 16 培养基液滴中重复此冲洗操作步骤 3 次。

c. 为了转导病毒颗粒，所用病毒滴定量在 IO⁹ 个病毒粒子/m i。在 M 16 中 1 〇〇 倍稀释病毒。转移晶胚到 30/xl 液滴的稀释的病毒溶液中，用移液管上下吹吸几次，然后转移单个的晶胚到一个单独的 IOul的矿物油覆盖的稀释病毒液滴。 37℃，5 % C 0 2 孵育 48 h 。

d. 48 h 后 ，晶胚应当发育为胚泡。用一个转移针转移发育好的胚泡到 2.5dpc 的假孕母鼠的子宫中（H o g a n etal.1994)。

带下注射

a•注射 h C G 24 h 后 ，无菌条件下手术收集输卵管，转移到矿物油覆盖的50ul的M 2 液滴中。用一对精细镊轻轻从肿胀的壶腹部（输卵管的上部）释 放 晶 胚（单细胞期），然后转移晶胚到透明质酸酶 M 2 溶液，用酶来消化晶胚旁堆集的细胞。转移晶胚到新鲜的 M 2 培养基来洗掉透明质酸酶溶液，然后放到一滴 5 〇 ul矿物油覆盖的 M 16 培养基中。

b •解冻一个病毒预分装的（1 〇 ⁹ 个病毒粒子/m l ) 短 暂 离 心（高速离心 5 s ) 阻止细胞碎片堵塞微量移液管的嘴部。

c. 准备显微操作。装好注射针后，点 5ul 病毒悬液到一个细胞培养用圆形盖玻片，用负压通过针头。如果针头堵塞，用短暂的正压气流释放碎片。转移单细胞晶胚到一滴覆盖矿物油的 M 16 培养基。

显微注射可以用自制的微量移液管 （Loiset al.2002) 或定制的无菌 ICSI 微量移液管。

d•在倒置显微镜下进行注射操作。把含病毒的微量移液管装到显微操作仪上，把尖端降低到矿物油内直到其尖端在视野下可见。当持针拿住晶胚时打开正压气流，轻轻推微量移液器尖端穿过带层到卵周空间，不要损伤晶胚细胞膜。使尖端保留在带层到卵周空间 5〜10s。空间的一些增大表明存在正压。 37°C ， 5 %C O 2 孵育晶胚在矿物油覆盖的 M 16 培养基中直到移植。

e. 立即移植晶胚到 0. 5d p c 同步的假孕母鼠输卵管中或者培养晶胚 2〜3d 直到胚泡形成，然后移植到 2. 5d p c 同步的假孕母鼠的子宫中。