用 展 示 T A T 转 导 域 的 X 噬菌 体 输 送 D N A 到哺乳动物细胞

用 展 示 T A T 转 导 域 的 X 噬菌 体 输 送 D N A 到哺乳动物细胞

材料

试剂
细 胞 系 ： C O & l 、 293 (购于 R I K E N Cell B a n k , W a k o ， Saitama， Japan) 、 A 431、N I H -3T 3 、 W 138/V A 13/2R A (购 于 the Health Science Research Resource
B a n k ， T o k y o ， Japan) 和 H e L a

氯 化 铯

氯仿

D A P I (4，,6-diamidine-2-phenylindole H C l

DNaseI (Sigma-Aldrich)

H - S M 缓 冲 液（含 l O m m o l / L H E P E S ^ N a O H 溶 液 、 l O m m o l / L M g S O 4 溶 液 、l O O m m o l / L NaCl 溶 液 ， p H 7. 5)

L E 3 9 2 细胞

萤 光 素 酶 检 测 试 剂 盒（P r o m e ga)

Lysogenic Esc/ieric/iia coZi，人 D 1180-G F P ，或 D 1180 蛮 光 素 酶

培 养 基

D M E M 培 养 基 ，含 1 0 % 胎 牛 血 清 ，用 于 C O S ^l 、 293、 A 431、 N I H -3T 3 细胞培养

M E M 培 养 基 ，含 1 0 % 胎 牛 血 清 ，用 于 W I 38/V A 13/2R A 、 H e L a 细 胞 培 养

L B 培 养 基 ，含 10 g/L 胰 蛋 白 胨（BectonDickinson), 5 g/L 酵 母 提 取 液（Becton Dickinson) ， 10 g / L N a C l , 10m m o l /L M g S O 4 ， 10ug/ml 氨 节 西林

噬 菌 体 染 色 体 D N A (10n g ，纯 化 ， 2. 5 X l O ⁸个 拷 贝）

质 粒 ： pTrc-D 、 pTrc-T A T -D 、 pTrc-R G I > D 、 pTrc-V N -D 、 pTrc-N L S ——D ，从 pTDrcHis A 构 建（Invitrogen)

噬菌体

不 同 类 型 的 重 组 噬 菌 体（2.5X 10⁸pfu)

T A T 噬 菌 体（2. 5 X 10⁶pfu 或 2. 5 X 10⁹pfu)

野 生 型 噬 菌 体（2. 5 X 10¹⁰pfu)

仪器

透析袋

荧光显微镜

G F P A cube 和 W U cube (Olympus Optical C o .L t d , T o k y o , Japan)

class chamber slide

32°C 、 37° C 、 38°C 和 45°C 的培养箱

2 4 孔板

方 法

制备重组 X 噬菌体

1.32°C 下 ，用 L B ( 含 10m m o l /L M g S O 4、 100/ng/m L 麵节西林）培养质粒转化的溶源性 大 肠 杆 菌 ，直 到 O D m d 的 吸 光 值 达 到 0.3。

2.45°C 培养细菌 15m i n , 然 后 38°C 培 养 180m i n 。

3 . 用氣 仿（终浓度 1 0 % ) 和 D N a s e I (终浓度 IOlUgAnl) 处理细菌，收获噬菌体颗粒。

4•两轮氯化铯平衡离心分离噬菌体顆粒，然后在 H-SM 缓冲液中透析纯化。

5.用 LE392 细胞作为宿主细胞， 37°C 下用空斑实验（Plaqueassay) 测定滴度。

用重组噬菌体诱导标记基因的表达

6•在 24 孔板中将待转染细胞以每孔 2. 5X 10⁴ 个细胞的密度接种，培 养 I 2 h。

7•用培养基清洗细胞一次，用 含 2. 5 X IO⁸P fu 重组噬菌体或 IOng 纯化噬菌体染色体DNA 的 500ul培养基在 37°C 下培养细胞 6 h。

8•用培养基清洗细胞两次，继续培养 48 h。

9•收集细胞，用萤光素酶检测试剂盒定量分析萤光素酶的活性，用带标准差的平均相对荧光单位（RLU) 表示结果。

在培养细胞中原位检测 T A T -噬菌体介导的 G FP 的表达

10.以每孔 2. 5XIO⁴ 个的密度在 glass chamber slide 接种 COS^l 细胞，培 养 12 h。

11.用培养基清洗细胞一次，然后用含 2. 5 X IO¹⁰pfu 或 2. 5 X 10⁹p fu 的 T A T 噬 菌 体 ,或 2. 5X 10¹⁰Pfu 的野生型噬菌体的 500ul 养基在 37°C 下培养细胞 6 h。

12.用培养基清洗细胞两次，继续培养 48 h。

1 3 . 收集细胞，用 D A P I 将细胞核染色，用荧光显微镜观察 G F P 的表达。