转 座 子 s iR N A 输送

转 座 子 s iR N A 输送

材料

试剂

琼 脂 糖 凝 胶（0 . 9 % ) , 根 据 标 准 方 法 制 备

B G H 反 向 引 物（5’-T A G A A G G C A C A G TC G A G G ——3。（In vitrogen )

转 染 试 剂 L i p ofectAMINE Plus (Invitrogen)

NEBuffer 3 ( N e w England Biolabs)

编 码 目 标 基 因 s h R N A 的 寡 聚 核 苷 酸

建议高效液相色谱纯化， 5’端 憐 酸 化（OperonBiotechnologies， Huntsville, Alabama)。

Q I A E X II Gel Extraction Kit (Q I A G E N )

Q I A G E N Ma x i Prep

限 制 酶 ： B w w B I 和 EcoRI ( N e w England Biolabs)

含 驱 动 s h R N A 表 达 的 pol I I I 启 动 子 的 S B 转 座 子 质 粒

pMaleficent (Heggestad et al. 200 4 ) 或 FP 体系 pFP/Neo^Hl (Kaufman et al. 2005)。

SB 转 座 酶 表 达 质 粒 pCM V-SBlO (Ivies et al. 1997)

也 可 使 用 其他 高活 性颠换 突变子 ，如 pCMV-HSB17 (B a u s e ta l.2005)、 pCMV-HSB4(Y an tetaL 2004)。 如果用 F P , 可使用表达质粒 PFV-FP (Kaufman e ta l.2005)。

含 G 418 (0.5〜 l m g /m l ) 的 培 养 基

T 4 D N A 连 接 酶（N e w England Biolabs)

瞬 时 转 染 的 目 标 细 胞 株

仪器

沸 水 浴

组 织 培 养 板（I O c m )

16°C 、 37°C 和 55°C 水 浴

方法

寡核苷酸的合成

1 . 设 计 针 对 目 标 基 因 的 寡 核 苷 酸 对
文献中介绍了序列设计的方法（ Schwarz et al.2003; Reynolds et al.2004; Boese et al.2005;Heale et al.2005)。也可从OligoEngine(littp://www.cerebre^com/indeundefinedhtml) 或 Ambion
(h ttp ://www.ambion.com/techlib/tb/tb _ 506. html) 获得在线帮助。至少合成三种不同序列的寡核苷酸，以及一个对照寡核苷酸对。

2• 对 于 pMaleficent 载 体 ，在 5’ 端 和 3’端 设 计 悬 垂 ，与 B s m B I 和 E c 0R I 限 制 性 连 接 位点 相 容 ，并 且 含 合 适 的 环 结 构 和 终 止 信 号（H e g g e s t a d e t a L 2004)。对 于 F P 载 体p F P /N e o -H l ，考虑 Bglll和 HindIII。

3• 寡 核 苷 酸 对（每 50p m o l 溶 于 50Ul 蒸 馏 水 中）经 沸 水 浴 复 性 处 理 2m i n ，缓 慢 冷 却 至室 温（超 过 大 约 20m i n ) 。连接到转座子

4 . 3 7 。 C 下 ，在 NEBuffer3 中用约 20U 的 Ec:oRI 剪切转座子质粒 pMaleficent(2ug)lh(反 应 体 积 20ul)。

5 . 加 人 IOU B sm B I 至 上 述 反 应 管 中 ， 55°C 培 养 2 h 。

6 . 用 0•9 % 的 琼 脂 糖 凝 胶 分 离 酶 切 产 物 ，用 Q IA EX II Gel E x tractio n K i t 纯 化 约 6k b 的剪 切 带 。

7 . 在 20M 1 的 反 应 中 ，用 T 4 D N A 连 接 酶 将 琼 脂 糖 凝 胶 纯 化 的 载 体（1ul 或 50n g ) 连 接到 复 性 处 理 的 寡 核 苷 酸（5ul)。

8 . 细 菌 转 化 连 接 产 物（约 3ul ) , 挑 取 氨 苄 西 林 抗 性 菌 落 ，用 B G H 反 向 引 物 V -TA G A A G G C A C A G T C G A G G ^ 进 行 分 析 。

9• 确 定 正 确 的 克 隆 后 ，对 质 粒 进 行 大 量 扩 增 （Q I A E N Maxi P rep ) 。

细胞转染

1 0 . 用 转 染 试 剂 L ipofectA M IN E P l u s 或 其 他 高 转 染 方 法 ，将 高 品 质 质 粒 D N A 转人目标 细 胞 。

1 1 . 建 议 pM aleficen t 和 转 座 酶 表 达 质 粒 的 质 量 比 为 4 : 1 。

12• 转 染 2d 后 ，收 集 细 胞 并 计 数 。将 5 X 10
³〜 IXIO⁵ 个 细 胞 种 在 IOcm 的 培 养 板 上 ，用含 G 418 (0.5〜 l m g /m l ) 的 培 养 基 培 养 14d ，每 7 天 换 一 次 培 养 基 。

在培养板上种植细胞的数量取决于转染效率以及细胞内 SB 转位的活性。

1 3 . 收 集 耐 受 性 克 隆 ，或 分 离 单 个 耐 受 性 克 隆 。冻 存 细 胞 ，并 通 过 蛋 白 质 印 迹 技 术 或 其他 方 法 分 析 基 因 表 达 的 下 调 。