PEG 化聚左旋赖氨酸/D N A 纳米颗粒的制备和分析

PEG 化聚左旋赖氨酸/D N A 纳米颗粒的制备和分析

材料

试剂

C K ₃₀

这种多肽氨基端为半胱氨酸，含 有 3 0 个赖氨酸残基，通常用三氟乙酸盐固相法合成，并通过 高 效 液 相 色 谱（HPLC)、质 谱 和 氨 基 酸 定 量 分 析 表 征 。其 纯 度 通 常 大 于 9 5 % (CK28-CK31 含量)，二聚体含量低于 1 % 。冻干多肽在氩气保护下一 20°C 保存一年后，快速蛋白质液相色谱和定量 4, 4-二硫二吡啶分析显示纯度保持在 9 0 % 以上。

葡 萄 糖（5 % ) 或 Na C l (0.9%)

二 甲 亚 砜（D M S O )

P E G 单甲醚马来酰亚胺衍生物（m P E G -M A L -10k ) (分子质量 I OkDa)mPEG-MAL-I O k 可 以 从 Nektar Therapeutics 购买。其分子质量和分散度经凝胶渗透色谱法确定。上 述 原 料 8 0 % 的 PEG 链末端应连接有官能化马来酰亚胺基团，这可通过 1 H-NMR分析验证。杂 质 含 量（P E G 二 聚 体 ）应 小 于 1 0 % 。实 验 中 也 可 以 使 用 5kD a 或 20kDa的 PEG。

磷酸盐缓冲液（P B S ) (0. lmol/L ， p H 7. 2) / E D T A (5m m o l /L ) (配方参考 S a m -brook and Russell 2001)

质粒 D N A (0.2m g /m l 水溶液）

用细菌扩增质粒，碱 裂 解 后 用 CsCl-ethidiumbromide 梯 度 离 心 纯 化 。然 后 用 0.1 体积的3m 〇 l/L 乙酸钠和 2. 5 体积的乙醇沉淀两次，并在水中重悬，浓度用紫外分光光度法测定。

所 获 得 的 D N A 用 R N a s e A < ! > 和 R N a s e T l 处 理 两 次 ，然 后 重 悬 至 终 浓 度 为 1 . 5〜2 mg/ml。质粒制备过程中应确保没有细菌染色体 D N A 或 R N A 污 染 ，开 环 和 线 性 D N A 含量应小于 3 0 % 。

注射用消毒水

这可以从 Baxter 买 到 。用 于 制 备 D N A 和 PEG 化的多肽水溶液。

三 氟 乙 酸（0. 1 % ) 或 50m m o l /L 乙酸铵

仪器.

琼脂糖凝胶和电泳装置

透析设备

葡聚糖 G l 5 柱子

分光光度计

透射电镜

方 法
P E G 化聚赖氨酸的制备（C K 3QP E G 1 0 k )

1.用 4 ,4’-二硫二卩比陡法（Grassetti and Murray 1967) 测试 C K 3 。中活性疏基的含量。活性巯基的含量的期望值根据多肽的质量、纯度、水 ‘的含量计算，含量一般应不少于 8 0 % 。

2•将 60 um ol CK 3。（三 氟 乙酸盐）溶于 15m l 0.1m o l/L PB S ( p H 7.2) /5p m o l/LE D T A 中。

3 .将 66umol mPEOMAL-10k 溶 于 15 mlDMSO。室温涡旋震荡下， 5m in 内逐滴加入到上述 C K 3。溶液中，继续搅拌 l h 。

这个反应 mPEG-MAL-lOk 应过量 10% (基于马来酰亚胺的活性）。 p H 为 7 时马来酰亚胺与巯基的反应比与氨基的反应快 1000 倍（Hermanson 1996)。

4 用 4, 4’-二硫二吡啶法测试巯基含量，确保反应完全。 C K 3。的 P E G 接枝率应接近 1 0 0 % 。

上述 PEG 化 CK3。产物仅在巯基反应了 9 0 % 以上时才能使用。

5.用葡聚糖凝胶 G 15 纯化反应产物，使 用 0 . 1 % 的三氟乙酸或 50m m 〇 l/L 的乙酸铵溶液平衡凝胶柱。在 220n m 下鉴定含有多肽的流出组分，收集并冻干。冻干后的 PEG 化聚赖氨酸在一 20°C 下可保存至少 2 年。

纳米颗粒的制备

6 . 用水重悬 CK38P E G lO k , 使终浓度为 7.1m g /m l (三氟乙酸盐）或 6.4m g /m l (乙酸盐)。

7.将 0 •9m l D N A (0•2m g / m l 的水溶液）等分，每份 IOOfil 加入到 〇 • Iml C K 30P E G l O k的重悬液中，室温下振荡 2m i n 。

DNA 终浓度为〇.18 mg/ml, 正负电荷比为 2 : 1 (NH3+/PO4- )

8.4°C 下将上述样品用 5% 葡 萄 糖 或 〇.9% 氯化钠溶液透析，以除去游离的 C K 3eP E G l O k和未反应的 P E G 。

纳米频粒的分析

9•通过透射电镜观察颗粒的形貌。所制得的纳米颗粒需满足下列规范：纳米颗粒不聚集 ，电子密集，当三氟乙酸作为反离子时形状为椭圆，而乙酸为反离子时为棒状；粒子的粒径应与质粒粒径一致。

10.琼脂糖凝胶分析颗粒。应检测不到游离或降解的 D N A , 颗粒应保留在上样孔中或只是轻微向前移动。颗粒用 7 5 % 鼠血清 37°C 处 理 2 h ，接着室温用 2. 5 % 胰酶处理40m i n ，或是用 D N a s e 培养，应有大于 9 5 % 的 D N A 结构完整，尽管超螺旋 D N A可能被切断。

11.颗粒在生理盐水中的稳定性。室温下， 3400 g 离 心 I m i n, 上清液在 260n m 的吸光值（A 2 w ) 与起始颗粒悬液 A 26。的比值应该是（1 ± 10)% 。

12.D N A 浊 度 测 定（Ziady etal.2003a)。 将颗粒悬液的表观吸收值（纵坐标）对波长.(330〜415n m ，横坐标） 均按对数坐标作图，直线的斜率应在一 3. 5〜一 4.5。