体外转基因载体 S L N 的制备

体外转基因载体 S L N 的制备

材料

试剂

待 转 染 的 细 胞 系

无 血 清 细 胞 培 养 基 ，针 对 合 遙 的 细 胞 系

胎 牛 血 清（ F C S )

庆 大 霉 素（ Invitrogen 15710-049 )

H B S ( H E P E S 缓 冲 生 理 盐 水 )

150m m o l / L N a C l

10m m o l / L H E P E S ( p H 7. 4)

青 霉 素 /链 霉 素（G I B C O 15140-122)

质 粒 D N A
固 体 脂 质 纳 米 粒（S L N )

棕 榈 酸 鲸 腊 酯（H e n k e l ， Diisseldorf，德 国）

D O T A P (Sig m a -Aldrich)

S p a n 85 (ICI Surfacants， Everberg ， Belgium )

T w e e n -80 (ICI Surfacants， Everberg , B e lgium )

S L N 使 用 热 高 压 均 质 法 制 备（ Muller etal.2 0 0 0 b)。 将 固 体 脂 质 加 热 到 超 过 其 熔点 l 〇°C 。

表面活性剂 Tween-80 和 Span 8 5 按 7 : 3 混合。将 混 合 物（2 % m /m ) 与 1 % (ot/ot) 阳离子 脂 质 D O T A P 在热的水溶液中混合，进一步和基本脂质棕榈酸鲸腊酯（4 % m /m ) 混合,高 速 搅 拌 lmin，形成前乳液，然 后 在 85°C 、 480bar 的压力用高压匀浆器均质化 4 次 。

T A T 2 多 肽

T A T 2 多肽序列为： C (Y g r k k r r q r r r g )2，富含精氨酸。 T a t 2 多 肽 按 标 准 F m 0c 方法用自动多肽合成仪合成，反 相 高 效 液 相 色 谱（H P L C ) 纯 化 ，并 经 质谱分析 。游离巯基用二硫二吡啶反应进行修饰（Plank etal.1999)。该修饰对于避免 T A T 2 多肽在溶液中形成二硫键非常重要。

仪器

自 动 合 成 仪（431A ; AppliedBiosystems)

细 胞 培 养 板（2 4 孔）

高压匀浆器（EmulsiFlex-B 3; Avesti n l n c ， O t t a w a ， C a n a d a )

高速® 拌 器（Ultra T u r r a x T 25; Jahnke and K u n k e l ， G e r m a n y )

培 养 箱 （37°C , 5 % C O 2)

反 相 高 效 液 相 色 谱 （H P L C )

方 法

合成 SLN-基因载体的复合物

1 . 为 24 孔板的每孔准备以下溶液。

a . 用 H B S 稀 释 l ug 的质粒 D N A 至 5 〇 ul 。

b •用 H B S 稀释 0. 65 ug TA T2 多肽至 50ul。

c•用 HBS 稀释 2. 5 吨ug SLN 至 50m1。

2.制备 T A T 2-D N A 复合物，将质粒 D N A 溶液加人到 T A T 2 溶液中。用移液管吸入吹出 1 〇次使其充分混合，室温下培养 lO m in。

3•制备三元复合物时，将 S L N 溶液加人到 T A T 2-D N A 复合物中。用移液管吸入吹出次使之充分混合，室温下培养 lOmin。

体外转录实验

4•转染前一天，将细胞接种在 24 孔板，培养基含 F C S 。
细胞在转染时应该有 6 0 % 〜7 0 % 的细胞密度。

5•将每孔的细胞培养基吸出，用 850^1 的无血清培养基替代。

6 . 加 人 150ul S L N ^基因载体三元复合物溶液 （步骤 3 制得）到细胞中。 37°C ， 5 % C O 2下培养 4 h 。

7•吸出转染液。用 含 10% F C S 、 0 . 1 % 的青霉素/链霉素和 0.5% (V/V ) 庆大霉素的培养基继续培养。

8•在指定时间检测基因转染效率。