PEI/DNA 纳米颗粒的制备和转染

 

材料

试剂

二 甲基亚砜（D M S O ; Sigma-Aldrich)

D M E M (Dulbecco’s modified Eagles’s m e d i u m ) 细胞培养基，含 1 0 % 胎牛血清(F B S )

氯 化 锂（LiCl， Sigma-Aldrich)

萤光素酶检测试剂（P r o mega)

哺乳动物细胞（指数增长期）

无血清 Opti-M E M 细胞培养基（Invitrogen)

PEI 聚 合 物（M.W. 600 〜 IOOOkDa, Fluka; M.W. 750kDa、 25kDa、 2kDa 和800Da， Sigma-Aldrich; M.W. I. 2kDa、 IOkDa 或 70kDa， Polysciences)

多肽，固相化学合成方法制备

磷酸盐缓冲液（P B S )

0 •lmol/L 磷酸钠盐缓冲溶液（p H 7. 4)

0.15m o l/L NaCl

质 粒 D N A ，编 码 萤 光 素 报 道 基 因

5X 报道基因裂解缓冲液（P r o mega)，用 P B S 稀释成 1 倍液
S M C C [succinimidyl-4-(N -maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylate] (Pierce)

超纯水

仪器

D c 蛋白质检测试剂盒（Bio-R a d )

透析膜

冻干机

萤光素酶检测仪

磁力搅拌器和磁子

反应瓶

组织培养瓶

方 法

用交联剂活化 PEI

1• 准 备 S M C C 储 存 液（50m m o l /L ，溶 于 D M S O )
SMCC 易水解。在干燥 H 保护下用无水 DMSO 配置储存液。 4°C 下储存液可以稳定存储 3个月。步 骤 1〜10 操作需要在化学通风橱中进行，遵循化学安全操作规范。 “

2 . 用 D M S O 配 制 10m g /m l 的 P E I 溶 液 。加 人 2〜 5m g LiCl 增 加 P E I 的溶解 性 。

3 • 用 注 射 器 将 S M C C 缓 慢 加 人 到 P E I 溶 液 中 ，室 温 下 反 应 2 h 。

SMCC 溶液的用量按所需要的 SMCC 和 P E I 摩尔比计算。

4 • 在 超 纯 水 中 将 修 饰 后 的 P E I 透 析 2d , 每 天 换 水 至 少 5 次 。

5 . 收 集 透 析 袋 中 的 溶 液 ，样 品 冻 干 。

偶联活化的 P E I 和多肽

6 . 用 P B S 作溶剂溶解多肽，制备 20〜50m m 〇 l/L 的溶液。

7•用 P B S 作溶剂溶解活化的 P E I (步骤 5)，制 备 l O m g /m l 的溶液。

8•将多肽溶液缓慢加人到活化的 P E I 中，室温下反应 24 h 。

多肽的用量取决于最终需要的偶联的摩尔比例。

9.将多肽偶联后的 P E I 在超纯水中透析 2d ，每天换水至少 5 次。

10.收集透析袋中的溶液，样品冻干。

制备 P E I / D N A 的复合物

11.配制储存液

a. 在超纯水中配置 l m g /m l 的质粒DNA的储存液。

b . 配置 P E I (步骤 5 ) 的储存液，或者多肽偶联的 p EI (步骤 1 0 ) 的储存液，其中氨基 N 的含量为 l 〇 n m 〇 l/m l (p H 7. 2)。

c•制备三元复合物，需要在超纯水中配制 5mg/ml 的含有 D N A 结合序列的靶向肽的储存液。步 骤 11〜22 需要在无菌环境下使用灭菌的试剂，室温下在平流的超净台中制备复合物。

12•配制工作液

a•将 Iug 的质粒 D N A 稀释到 50ul 的无血清 Opti-M E M 中（用于转染 24 孔板中的细胞)。

b. 用 50ul 无血清 Opti-M E M ，稀释含合适量的 P E I 或多肽偶联的 P E I 。

c. 制备三元复合物，用 50ul 无血清 Opti-M E M 稀释含合适量的多肽。

13.在蜗旋振荡下，将多肽偶联的 P E I 逐滴加人到 D N A 溶液中。对于三元复合物，在蜗旋振荡时，将多肽逐滴加入到 D N A 溶液中。

14.室温培养 3 〇 m i n 。

多肽偶联的 PEI/DNA 复合物也可以直接用于转染（步 骤 16)。

15.制备三元复合物，在蜗旋振荡下，将 P E I 溶液逐滴加入到靶向多肽/D N A 复合物溶液中，室温下培养 30m i n 。

三元复合物也可以直接用于转染（步 骤 16)。

转染检测

16•转染前一天，将哺乳动物细胞按每孔 50 O O O 的密度接种到 24 孔板中，使用含 10%胎牛血清的 D M E M 完全培养基，在 37°C , 5 % C O 2 下培养 24h。

17 吸除培养基，用 P B S (37°C 预热）将细胞清洗 2 遍。

18•按顺序进行如下操作：

每孔加人 100〜150ul无血清 Opti-M E M ;

每孔加人 100〜15 〇 4 D N A 复合物，含 1 鸿 质 粒 D N A (步骤 14 或 15)

37℃， 5% C O 2 下培养细胞 4 h。

19•吸除转染溶液。用 P B S (37°C 预热）清 洗 2 遍。加 人 I m l 含 1 0 % 胎牛血清的D M E M 完全培养基，培养细胞 24〜48 h 。

20.检测萤光素酶的表达。每孔加入 IOOul 的 I X 报道基因裂解缓冲液，裂解细胞。

21•为了检测萤光素酶的活性，将 20ul 细胞裂解液加人到 IOO ul 萤光素酶检测试剂中，用萤光素酶检测仪检测萤光素酶的活性。

22•为了归一化萤光素酶活性，用 D 。蛋白质检测试剂盒来测定细胞裂解液中的蛋白质含量。