用于基因传输的 H V J 脂质体和 H V J 包装载体的制备

材料

试剂

B S S (缓 冲 盐 溶 液）

137m m o l / L NaCl

5.4m m o l / L K C l

10m m o l / L Tris-HCl ( p H 7. 6)

将 8 g NaCl、 0. 4 g K C l 和 I .21 g T ris 碱溶解在蒸馏 水 中 ，用 lmol/L 盐 酸 调 节 p H 至 7. 6,再用蒸馏水定容到 1L。高压灭菌， 4°C 储藏。

牛 脑 磷 脂 酰 丝 氨 酸 钠 胆 盐（P S ) , 色 谱 纯（Avanti Polar Lipids Inc.)

氯 仿（Sigma-Aldrich)

胆 固 醇（Sigma-Aldrich)

D C -胆 固 醇（Avanti Polar Lipids Inc.)

D M S O (二 甲亚砜）（Sigma-AWr i c h )

D O P E (1， 2-二 油 酰 磷 脂 酰 乙 醇 胺）（Sigma-Aldrich)
从 H V J (Z 系 ， V R -105, A T C O 而 来 的 H V J 种子
将 H V J 最好的种子保存在 1 0 % 的 D M SO 中， 100ul 分装。

氮气

磷 酸 盐 缓 冲 液（P B S )

从 鸡 蛋 黄 中 提 取 的 卵 磷 脂（P C ) (Sigma-Aldrich)

质 粒 D N A

柱色谱纯化质粒 D N A ，溶 于 T E (tog/ml) 缓冲液， B S S 或水中，保存在一 20℃。 D N A的终浓度应该大于 lmg/ml。

多 聚 蛋 白 胨 溶 液

1 % 多 聚 蛋 白 胨（酪 蛋 白 的 胰 腺 消 化 物 ；W a k o , O s a k a , Japan)

0 . 2 % NaCl ( p H 7.2)

将 5 g 多聚蛋白胨和 Ig NaCl 溶解在蒸馏水中，用 l m 〇 l/L N a O H 溶液调整 PH 至 7.2 , 再用蒸馏水定容到 500m l, 高压灭菌后 4°C 储 藏 。

硫 酸 鱼 精 蛋 白（l O m g /m l , 溶 于 P B S 中）

鞘 鱗 脂（Sigma-Aldrich)

蔗 糖 梯 度 溶 液

将 150 g 和 300 g 蔗糖分别溶于 BSS 中 ，再 用 BSS 定 容 到 500m l, 高压灭菌后 4℃ 储 藏 ，获得

3 0 % 和 6 0 % (m/V) 的蔗糖溶液。

T r i s - E D T A (T E )

10m m o l / L Tris-Cl ( p H 8. 0)

lmmol/』L E D T A

TritonX-IOO ( 2 % , 溶 于 T E 溶 液 中）

仪器

醋 酸 纤 维 素 滤 膜（〇.45um 和 0.2 〇 um) (Nalgene)

离 心 机（J2-H S ) ，含 J A -20 的转子和 35 ml 离 心 管
（BeckmanInstruments)

低 速 离 心 机（05P R -22， Hitachi, T o k y o ， Japan)

分 离 柱（不 含 内 霉 素 ，用 于 制 备 质 粒 D N A ) (Q I A G E N )

塑 料 离 心 管（50m l ) (Becton-Dickinson)

玻 璃 管（24m m 口 径 ， 12c m 长）（Fujiston 24/40， Iwaki Class C a L t d ， T o k y o ,Japan)

这些玻璃管可以定做，也可使用类似抗氯仿腐蚀的灭菌管。新管在使用前在饱和的 K O H -乙醇溶液中浸泡 24 h , 用蒸馏水清洗后， 180°℃下 加 热 2 h 。

分 光 光 度 仪（D U -68， B e c k m a n Instruments)

旋 转 蒸 发 仪（型 号 S R -65 〇 ， T o k y o Rikakikai Inc. ， T o k y o ， Japan)

超 速 离 心 机 ，带 R P S -40T 转 子（55P -72， Hitachi)
超 速 离 心 机 管（12m l ) (Hitachi)

紫 外 交 联 仪（Spectrolinker X L -1000， Spectronics C o . )

带 压 力 表 的 真 空 泵（A s p ——13 型 ， I w a k i G l a s s C o . Ltd. ， T o k y o ， Japan)

方法

在即将孵出小鸡的鸡蛋中制备 HVJ

1•将 H V J 病毒种子迅速解冻，然后用多聚蛋白胨溶液按 1 : 1000 的比例稀释。将稀释后的种子保存在 4°C , 直到开始下一步实验。

2.室温条件下，在黑室中用光照观察鸡胚，在绒毛尿囊膜上方约 0.5m m 处标记上一个注射的点，用碘酊消毒后在标记处穿刺。

3•用带 26 号针头的 I m l 无菌注射器将 0. I m l 稀释的病毒种子注射人每个鸡蛋中。将针头垂直插入以便刺破绒毛尿囊膜。

4 •接种病毒种子之后，将鸡蛋上由于注射所形成的洞用融化的石蜡覆盖，在 36. 5 ° C 和充足的湿度条件下培养鸡蛋 4d 。在收获病毒之前要将鸡蛋在 4°C 下预冷至少 6 h 。

5 . 收获病毒：剥去一部分鸡蛋壳，用 带 18 号针头的 I O m l 注射器将绒毛尿囊膜胚液转移到灭菌瓶中， 4°C 保存，避免结冰。

这一步可以在室温条件下完成，病毒在液体中可以稳定存在 3 个 月 。

绒毛尿囊膜胚液 H V J 的纯化

6 . 将 2 0 0 m l 绒毛尿囊膜胚液分装到 4 个 5 0 m l 锥形离心管中，用低速离心机在 4°C ,3 0 0 0 r / m in (IO O O gO 离心 lO m in 。

7•将上清分装在 6 个 离 心 管（B e c k m a n J & 2 0 ) 中，在 4 ° C ， 15 0 0 0 r / m in ( 2 7 OOOg) 离心 3 0 m in 。

8.在每个离心管的沉淀中加入 5m l B S S ，在 4°C 条件下过夜。

9.轻轻地将沉淀重悬浮，悬液分装在两个离心管中，按步骤 6 的设置离心。

10.再在每管中加人 5m l B S S ，在 4°C 条件下培养 8 h 以上。

11.轻轻重悬沉淀， 4°C , 3 0 0 0 r / m in (I O O O g) 离 心 1 5 m in 。 将上清转移到一个无菌管中 ， 4°C 保 存 。

1 2 . 将 上 清 稀 释 1 0 倍 后 ，用 分 光 光 度 计 在 540n m 处 测 量 吸 光 度 来 确 定 病 毒 的 浓 度 。

H V J 可 以 利 用 紫 外 交 联 仪 在 99mjoules/c m 2 的 强 度 照 射 下 灭 活 。

在 540nm 处的一个光学密度单位与 15 〇〇〇 个红血球凝聚单位相当，而红血球凝聚单位可以反映融合的活性。按照上述方法制备的上清通常显示 20 000〜30 000 HAU/mL。无菌制备的病毒溶液可以保持融合活性 3 个星期，用 紫 外 照 射 灭 活 的 H V J 可 以 保 存 在 1 0 % 的 DMS O 中，在 一 80°C 或 一 170°C (液氮中）活性可以保持超过 6 个 月 。

脂类复合物的制备

13•将 D O P E (12. 2m g ) 、鞘 磷 脂（11.5m g ) 、胆 固 醇（23.8m g ) 溶 于 387 〇 ul氯 仿 中 ，制 备 脂 类 溶 液 ；将 I O O m g P C 溶 解 在 I m l 氯 仿 中 ，取 130ul与 3870ul 脂 类 溶 液混 合 。

制 得 的 4OOOul 混合物称为脂质体的基本混合物，更高级的混合物被用来制备阴离子或阳离子 脂 质 体（如下所示 ），或者氮气下一 20° C 保 存 。

1 4 . 阴 离 子 脂 质 体 混 合 物 的 制 备 ：加 入 I O m g 的 P S 到 上 述 基 本 混 合 物 中 去 ； 阳 离 子 脂质 体 的 制 备 ：加 人 6m g 的 D C -胆 固 醇 到 上 述 基 本 混 合 物 中 去 。

15• 将 得 到 的 脂 类 溶 液 分 装 到 8 个 玻 璃 管 中 ，每 管 含 0. 5m l ，其 中 包 括 8. 8m g 脂 类 物质 ，把 这 些 玻 璃 管 置 于 冰 上 或 者 氮 气 中 一 20°C 保 存 ，直 到 挥 发 溶 剂 之 前 。

脂类溶液应该尽快将其中的溶剂挥发。

1 6 . 将 玻 璃 管 连 接 到 旋 转 蒸 发 仪 上 ，将 玻 璃 管 的 端 部 浸 没 在 40°C 的 水 浴 中 ，在 真 空 条 件下 蒸 发 有 机 溶 剂 5〜 lOmin。

适合于做脂质体的脂类物质是那些紧贴在玻璃管内壁上并形成薄层的，沉积在管底部的脂类物质则并不合适。将得到的脂类物质在氮气中一 20℃保 存 ，有 效 期 为 1 个 月 。

HVJ 载体的制备和输送

17• 用 于 融 合 介 导 基 因 转 染 的 H V J 载 体 的 制 备
含 D N A 的 H V J 脂 质 体 的 制 备（图 2)

a. 将 质 粒 D N A (200M 中 含 有 200/i g 的 D N A ) 加 入 到 一 玻 璃 管 的 脂 类 混 合 物 中( 步 骤 1 6 ) , 涡 旋 振 荡 30s，接 着 在 37°C 中 培 养 30s。如 此 循 环 8 次 。

用这种方法，质 粒 DNA (最 大 20kb) 能 够 以 1 0 % 〜3 0 % 的效率被阴离子脂质体包裹，或者 以 5 0 % 〜6 0 % 的效率被阳离子脂质体包裹。

b. 将 脂 质 体 悬 液 通 过 〇.45um 孔 径 的 醋 酸 纤 维 素 滤 膜 ，再 通 过 孔 径 为 〇.2um 的 膜 ，获 得 粒 径 均 一 的 脂 质 体 。

使用带有聚碳酸酯滤膜的挤出机制备脂质体得到的粒径更均一。

c• 加 人 15 OOOHVU 的 紫 外 灭 活 H V J 病 毒 到 脂 质 体 悬 液 中 ，将 玻 璃 管 置 于 冰 上5〜 I O m i n , 然 后 在 恒 温 37°C 的 振 荡 水 浴 锅 （速 率 120/min) 中 培 养 l h 。

d. 在 离 心 管 中 先 加 人 Iml 6 0 % 的 蔗 糖 溶 液 ，再 加 人 7m l 3 0 % 的 蔗 糖 溶 液 ，在 其 上覆 盖 H V J-脂 质 体 混 合 物 ，最 后 用 B S S 将 离 心 管 装 满 。

e. 用 蔗 糖 梯 度 离 心 的 方 法 分 离 H V J -脂 质 体 复 合 物 和 H V J ，在 4°C , 62 O O O g 的条