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    基本方案 反转录病毒介导的基质细胞支持 CD34+ 细胞转导

    相关实验：人造血干细胞的培养、转导和分析实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    人骨髓、脐带血或用抗凝血剂处理的外周血
    HBSS PBS BBMM 包被磁珠的鼠抗IgG 反转录病毒载体上清液 鱼精蛋白硫酸盐 LBMM G418 HEPES 溶液
    转导培养基 甲基纤维素培养基 铯辐射源 离心管 旋转平台 免疫磁性选择装置 注射器 培养皿

    步骤

    1. 〇天 ：准备初期的人间质细胞，铯辐射源照射它们。需要一个非转导用培养瓶，用于 接收培养基。 2.1天：收获骨髓，脐血和外周血细胞样本。分 别 用 H B S S 和 P B S 调节骨髓和血样本 体积相同。 3. 在 IOml I O X P B S 中加人 90ml Percoll, 配成 “100% Percoll”。将 IOOml 100%Percoll 加入到39ml H B S S 中配成7 2 % P ercoIl (可以根据需要调高或调低用量） 。 4. 小 心 地 将 15ml 72%Percoll加 入 到 50m l 聚 丙 烯 离 心 管 中 ，再 加 入 5ml FicollHypaque和 30m l 稀释的细胞悬液。不要混合液体层。
    5 . 室温下73〇 g 离 心 15m i n 。从顶部吸去2/3的黄色血清层。再吸出血沉粽黄层（ 不透 明的单核细胞裂解物） ，少 于 IOxnl, 移入到一个新的50m l 管中。 6. 将 4〇 m l H B S S 或 P B S 加人到单核细胞中，混合。室 温 下 400g•离心5m i n ，弃去上 清 ，轻弹管底，使细胞能够脱离紧密的细胞沉淀。如果细胞是来源于骨髓，继续第7 步 ；如果细胞来源于脐带血或活动的周边血样，继续第9 步。 7•在Iml B B M M 中重悬骨髓细胞沉淀。细胞计数并用台盼蓝测定细胞活度（ 附录31)。 用 B B M M 稀释到 I X l O 6 个细胞/m l 。移去任何存在的细胞团块。 8. 将 15m l 细胞悬液加入到胶原酶处理过的75c m 2 的带有〇.2^m 过滤透气瓶盖的组织 土首养瓶中。将培养瓶放人培养箱中，让间质细胞贴壁2h 。移去非贴壁的造血细胞， 加入到50m l 离心管中。用 P B S 洗几次培养瓶，并加入到50m l 管中。 间质细胞由于是C . D 34+并使得转导结果无效，所以要移去。培养瓶中的贴壁细 胞可以培养成间质单细胞层（ 支持方案4，第 3 步） 。 9•把间质细胞分离的单核细胞在4°C 下 ， 400g 离 心 5m i n 。移去上清，立即轻弹管底使 细胞沉淀重悬，避免团块的形成。 1O. 用 25m l 的预冷的P B S 洗一次细胞， 4°C下， 400g 离 心 5m i n 。弃去上清。用 I m l 预 冷的 P B S 重悬细胞沉淀。将分装的一管细胞计数，并测定细胞活度。去除任何存在 的细胞团块。将细胞保持在4°C 直到分选完成。 1 I•每I X l O 7 个细胞中加人l m i预冷的P B S , 移入到一个15m 丨的离心管中。在5jug/ml 的细胞悬液中加人无菌的抗C D 3 4 的 抗 体 （ 或由初始的滴定实验决定） 。 4°C 在滚动 的平台上孵育30m i n 。 如果使用的细胞数量很少（ < 1 X 107 个细胞） ，在冷房内的竖直放置的盛有 〇.5m l P B S 的 15m l 管中进行抗体结合和D y n a b e a d 结合的测定。在结合的IOmi11的 间期轻弹管底使其轻轻混勾。洗抗体的步骤和浓度保持相同。 12. 4°C 下 ， 4〇〇尽离心5m i n ，移去上清。用 U m l 预冷的5 % F B S /P B S 重悬洗两次，离 心 ，移去上清。 13. 用预冷的P B S 重悬细胞沉淀。加人20W 山羊抗鼠Ig G 磁珠/m l 细胞悬液。 4°C 下在 缓 滚 动 的 平 台 上 解 育 30〜60m i n. 。 加入预冷的P B S 调整到最终体积为7m l 。将试管置于磁力器上，进行免疫沉淀。 2m m 后 ，小心地移除P B S ， 转人到标记了 C D 34-细胞的试管中。将试管从磁力器 上移去，用 7m l 预冷的P B S 洗 C D 34+ 细胞和磁珠。将试管放回磁力器上，在孵育 2m i n ，弃 去 P B S 部分。 磁性小珠可以用木瓜凝乳蛋白酶去除（ 支持方案3 ) 。 然 而 如 果可能，将 它们留 在细胞上。他们会在培养1〜2d 后脱落，不会妨碍转导、集落生成单位的形成或移 植物移入。木瓜凝乳蛋白酶处理会降低转导能力并去除一些细胞表 面 决 定子。 15. 立即在2m 丨转导介质中重悬C D 34+细 胞 （ 通常为1 % 骨髓）和小珠并计数细胞。每 个 25c m 2 培养瓶中的受辐照的人骨髓基质细胞（ 第 1 步） ，稀 释 I X IO4〜I ^ 107 C D 34+细胞至5m l 转 导 介 质 （ 最 大 I X I O 6 个细胞/m l)。 16. 从受辐照基质细胞中去除介质，立即加人5m l C D 34+ 细胞重悬物。不要让基质层干 透。至培养箱培养。确保介质温暖， p H 中性，培养箱中C O 2 浓度为4. 5 % 〜5.0%
    (不要过高） 。 17. ^ 最快速度溶解反转录病毒载体上清。从培养箱中取出培养瓶，加A 5 m l 反转录 毒载体上清和40^1的 l m g /m l 硫酸鱼精蛋白（ 终浓度4〇/ Ltg/m 丨 ） 。以最快速 养瓶放回培养箱中，继续培养24h 。 P 18•从转导瓶中小心收集上清，加 人 5m i 室 温 （ 最低）或 37<>c (最高）预执 质 ，放回培养箱中继续培养。 、… 19. f 〇 g ，代离心收集上清中的非黏附性细胞5m m 。去上清，用手指轻弹重悬 使细胞和小珠不会凝成块。 ％ ’ 20. 加 入 5m j 溶解并3r C 预热的反转录病毒载体上清至细胞中。重悬上清液中的细胞 放 口 至 养 瓶 。加 人 40]u l 硫酸鱼精蛋白，立即将培养瓶放回培养箱中，继续培 养 24.h 0 21. 重复第18〜20步一次。 22. 再培^ j 4h，直至准备从转导瓶中收获细胞用于集落生成单位平皿培养法测定决定 转导效率。 、用 G 418或其他选择剂（ 如红杉醇、秋水仙素或多药耐药基因）筛选进行 集 落 生成单位分析方法如下所述。对于没有选择标记的载体， 可 以 用单克隆]?(：1^ 分 析 （ 支 持 方 案 7 和 8 ) 。 23. 用 I O m l 移液管吸取瓶中培养基然后让培养基在贴壁细胞上漫过以从基质层 出转导细胞。不要将培养基雜喷到基质上，否 则 它 会 成 块 掉 。转移非黏附性 胞 （ 和培养基一起）至一新瓶子。用 L B M M 重新营养原贴壁层。 ，贴壁层会在下一个星期的过程中成为一个生长旺盛的长期骨髓培养（ l 丁 b _ M C )。如有必要，可从贴壁层中接种集落生成单位，支持方案6。 24. 培养非黏附性细胞此以上让基质细胞贴壁以减少分离的基质细胞。如果在瓶 很 多 大 的 麵 细 胞 ，将非黏附性细胞转移至一个新瓶子，如此重复，如 果 少 数 贴壁基质细胞，继续下一个步骤。 、 级 2 〇. 收集黏附性细胞。室 温 下 伽 尽 离 心 ^ ^ 。去上清， 重悬细胞团 台盼蓝处理=数细胞并分析细胞活力。细胞计数对平皿培养法的结果至关重‘ 所 以应对其进行四重计数。计算铺里的细胞容量： （ 每个皿所需细胞彳细胞数每毫升） 加人至每个皿的细麵悬物的微升量。如有必要，可对其浓缩或稀释以 使体积介于10〜80W 之 间 （ 关键性的） 。 对于从成人骨隨或外周血取得的C D 3 4 + 细胞，体外转导孤后以每1 5〇〇 个和 麵 个 细 胞 数 接 种 。对 于 脐 带 血 縣 细 胞 、新 生 儿 魏 细 胞 或其他途紐得的新分 禺的人C D 34+细 胞 （ 用于屏蔽或集落生成单位水平基线） ，每 孤 25〇个 和 5〇〇 个细 胞数接种。 产测疋非分裂单核细胞制品含量时，每1 用 5 X 104 个细胞，分 析 C B M + 细胞时 母狐用500和 1000个 细 胞 以 使 每 皿 产 生 〜 个 克 隆 2 6•应用无菌，术 ，准 确 吸 取 ― 甲 基 纤 维 素 至 — — 注射器。调剂至一个35醜 ^ I O m m 万格网组织培养皿。每 瓶 （ 转导和未转导的）准 备 8 个 该 种 瓶 子 （ 每个浓度 各 4 个)。
    27. 4 个皿加入 5〇 mg/ml G418 18yl，另 外 4 个 瓶 子 加 入 i〇〇 m m 〇 i/L H E P E S 缓冲 饥 ^ 的 ^ ：中加人经过计算的体积的造血细胞悬液。将培养基池置于板的-边，轻 轻振颤，在周围滚动以充分混合。 訂 糊 辺 ，粒 29. 置于一个带有—个 含 2m l 灭菌水的35m m M 的 10c m _ 培养皿中。在充 f 芑湿的37 C ，含 4. 5 % 〜 5 % C O 2 的培养箱中培养14〜21d 。 3〇.= 样本中残余部分的细胞接种至1〇ml L B M M 中一个双层的受辐照红细胞基 所上。 集落生成单位接种后剩余的细胞可以保存在L T B M C 中 （ 从 第 2 3 步加入狐 中） ，用于后续的载体表达测试。 31. ^ 除游离至培养基的成熟细胞、重新营养贴壁的细胞层（ 含有最初的原始造血 胞） 维 持 LTBMC。最初培养的两星期里，每 5 天去除7 5 % 的原有培养基及里面 的悬浮细胞，加入同等体积的新鲜LBMM营养细胞。 多 能 祖 细 胞 附 着 于 间 质 层 或 在 其 下 面 。在 最 大 膨 胀 期 间 （ 培 养 后 2 〜 4 周 ） ， 可 以考虑去除100 % 的培养基，轻轻冲洗附着的细胞层，以去除松散贴壁细胞，然后 加入培养基恢复 培 养 。通 过 快 速 补 充 非 黏 附的子代细胞可 以 最 大程度收获成熟细胞 却 不 会 减 少 最 原 始贴壁细胞。 两 周 内 可 以 收获非黏 附 细 胞 用 于 d n a 、 r n a 、 蛋 白 质 、免疫组织化学分析（ 支 持 方 案 9 ) 。 32. 培养末期，用下列标准计数并分类第29 步中所接种的皿的集落生成单位： 、 红系暴发集落形成单位（ B F U -E ): 至 少 3 个大的微红色的红细胞系统的细胞 群 ，其中有些呈红色；群中细胞是不完全圆的，细胞之间看起来在相互挤压；在群 之间的克隆中可能有一些白色的圆形细胞，是红细胞系统的细胞群的祖^^细胞。 粒细胞/巨噬细胞集落形成单位（ C F U -G M ):大 约 含 有 50 个细胞的克隆；所 有细胞都是白色，没有红细胞系统细胞发育；有些细胞可能比其中一些大3 倍以 上 ，并有一个明显的环圈在里面，这是成熟的含有溶酶体的巨噬细胞。 粒细胞/红细胞/巨噬细胞集落形成单位（ C F U -G E M ):具有上述各种细胞；可 能还含有巨核细胞（ C F U -G E M M )，他们是一些极大的具有多叶片细胞核的细胞。 33. 如果 G 418用于确定猶的转染程度，从相同细胞浓度细胞板中计算一系列细胞板 的抗性克隆数，即通过比较含有 G 418和 不 含 G 418的细胞板的克隆数： （ 含有 G 418细胞板的克隆数/不 含 G 418的细胞板的克隆数）X l O O = % G 4l8rcfu。 备 选 方 案 在 纤 维 连 接 蛋 白 涂 铺 的 盘 子 上 进 行 反 转 录 病 毒 介 导 的 转 导 附 加 材 料 （ 基 本 方 案 ；标V 的 条 目 参 见 附 录 1) 重组纤维连接蛋白C 端 片 段 （ retronectin; Bio_W h i t t a k e r) 或低压冻干的血浆纤维 含 有 C S ~1， R G D ，和肝磷脂结合结构域的C 端片段 V 2 % O n/y ) B S A : 去离子的1〇% B S A 用 P B S 按 1 : 5 稀 释 （ 见个别处方）
    细胞解离液（Life Technologies) 6 孔组织培养板或35m m 组织培养皿 1.准备用于转导的C D 34+细 胞 （ 基本方案，第 2〜15步） ，除将细胞密度调整至1.5 X IO5个细胞/m l外 。 2 . 以 50)ug/ml用 PBS重悬低压冻干的重组纤维连接蛋白C 端片段，冰冻并保存在 一20°C (避免反复冻融） ，或保存在4°C ，一个月内活性不会明显降低。 3. 加 2m l 纤维连接蛋白重悬物至6 孔组织培养板的孔或35m m 组织培养皿，室温下培 养 lh，去除纤维连接蛋白重悬物，加 2m l 2 % B S A 封闭之，室温下培养30min。为 方便，纤维连接蛋白重悬物可保持至12h 或 2 % B S A 培养4h 。 4. 去 除 B S A ，用 P B S 从边沿小心的清洗细胞板。立即加人细胞和反转录病毒上清液用 于转染。不要让孔干透。每个用于转导的样本， 6 孔板中每孔加2m l 含 C D 34+原始 细胞转导培养基和2m l 反转录病毒载体上清，培 养 24h 。 5•小心去除培养基，室 温 下 400g 离 心 5min。去除上清液，轻敲管子保持细胞分散。 将细胞重新接种至孔中，每孔加入新鲜的37°C 预热的转导培养基和2m l 反转录病毒 载体上清液，培养24h 。 • 6.按照生产商说明书用细胞解离液处理去除纤维连接蛋白层中原始细胞。清洗、计数 并接种细胞至甲基纤维素培养基，屏蔽菌落形成单位（ 基本方案，第 25〜33 步） 。 支 持 方 案 1 维 持 生 产 载 体 的 成 纤 维 细 胞 在含有15ml D l O H G ( 附 录 1 ) 的 75cm2 培养瓶中生长生产载体的成纤维细胞 (V P F )。当细胞密度达到8 0 % 时用胰蛋白酶处理传代以保持细胞不要过满。冻存早期 传代细胞作为原种。如果V P F 在体外培养达到几个星期，对其进行重新选择以确定其 含有载体和包装质粒。 A T C C 中有适合各种细胞系选择的信息。 从 V P F 中收集的上清的滴度在3T 3 细胞 的 测 量 时 必 须 大 于 5 X IO6 感染性单 位/m l。如果滴度过低，应该从包装细胞的原始细胞池重新获取新的高滴度的克隆（ 单 元 12. 4)〇 支 持 方 案 2 收 集 用 于 转 导 的 无 细 胞 上 清 材 料 （ 标V 的条目参见附录1) 培养生产载体的成纤维细胞（ V P F ，支持方案1 ) n/ D I O H G 培养基， 32°C 膜蛋白酶/乙—J安四乙酸溶液（ Bio-Whittaker) 75cm2 组织培养瓶，具 有 〇.2jum过滤通气孔道（ Costar) 32° C 增湿， 4.5% 〜 5.0 % C O 2培养箱 有乙酸I丐薄膜的0 •45jLim Unifl〇-25注射器式滤器 （Schleicher Schuell) IOml聚丙婦管. L 胰蛋白酶消化培养的V P F (附录31)，在 有 I O m l预温的D l O H G 培养基的75cm2 组 织培养瓶中以IO6 个细胞的浓度重新接种培养细胞。侧放培养瓶， 37°C培养箱培养
    1〜2d，直至细胞几乎长满。 2•用预热的D l O H G 培养基换液。转移培养瓶至32°C培养箱以产生上清液，培 养 48h。 3 . 收集上清液，清除长满的单层V P F 细胞。用有乙酸钙薄膜的〇 .4 5 p m Uniflo-25注射 器式滤器过滤上清液，用 I O m l 聚丙烯管 每 管 5 m l 储存上清液于一7(TC直至用于 转导。 支 持 方 案 3 从 免 疫 磁 测 定 选 择 的 细 胞 中 用 酶 去 除 磁 性 小 珠 C D 33和 C D 14抗原决定簇用木瓜凝乳蛋白酶分开，所以下续的基于这些抗原决定 簇的荧光激活细胞分类术（ F A C S ) 分析已经不可用。然而， C D 2、 C D 3、 C D 34 (H P - C A -2和 8G 12)、 C D 45抗原决定簇还在。 从分离的C D 34获得的纯度百分比可以这技术利用一小部分储存的细胞获得，然后 用 H P C A -2 抗 体 标 记 （Becton Dickinson Immunocytometry)，进一'步F A C S 分析。 注意：用于转导的细胞不应该用木瓜凝乳蛋白酶处理去磁性小珠。 材料 免疫磁测定选择的C D 34+细 胞 （ 基本方案） R P M I 培养基，含 1 % (m /V ) 人血清白蛋白（ R P M I / 1 % H S A ) 2500U/ml 木瓜凝乳蛋白酶（ Chymodactin， Baxter) Beckman G S -6R 离心机， G H 3. 7 转子或相等物 1. 在 R P M I /1% H S A 中重悬免疫磁测定选择的C D 34+细胞。室温下400g 离 心 5min， 再重复两次。 2. 用 I.8ml R P M I /1% H A S 重悬细胞并加2004 2500U /m l 的木瓜凝乳蛋白酶（ 总共 500U )。在室温孵育15min。像第一步那样洗细胞两次。 3 . 根据分析方法用培养基重悬细胞。 支 持 方 案 4 由 骨 髓 建 立 骨 髓 间 质 细 胞 单 层 材 料 （ 标V 的 条 目 参 见 附 录 1) 滤网用于过滤消化的骨髓或骨髓抽提物 V D O M V P B S Trypsin/versene solution (Bio-Whittaker) V H B S S V D l O H G medium V B B M M 2 5 c m 2 和 75c m2 的培养瓶，瓶盖上带有0. 2p m 的通气孔（ Costar) 铯 放 射 源 （ 如 Gammacell 1000， NordionInternationaD 1 . 从过滤骨髓的网筛上收集骨小梁，让其通过重力作用自然沉降。 如 果 没 有 滤 网 可 以 用 Ficoll-Hypaque/Percoll试 剂 做 密 度 梯 度 离 心 （ 基 本 方 案 ，
    矛 2〜8 步） ，下接弟3 步。冻存非附着的造血 细 胞 （ 支持方案1〇)。 2. 将骨小梁接种在加有15ml DOM的 75cm2 的培养瓶中， 37°C孵育。 3. 接种后2〜12h，完全弃去未附着的细胞。重 新 加 入 15m lD 〇M ，将培养瓶放回培 养箱。 4 . 当间质细胞汇合度达到8 0 % ，弃去原培养基，用 15mi pB S 洗 ，加 2mi 胰酶/乙二胺 四乙酸，轻拍瓶壁，轻轻晃动使其完全覆盖细胞层，弃去多余的胰酶，留约5〇〇 ^j 。 37° C孵 育 10〜15min，每 3〜4min晃动培养瓶使细胞层表面被完全覆盖。 5. 每瓶用45ml DOM重悬细胞，按每瓶15m l转移至3 个新的75cm组织培养瓶。弃去 原培养瓶。继续培养间质细胞至汇合度8 0 % ，再次传代。 6. 重复一次第4〜5 步，产 生 第 3 代间充质细胞。如果细胞层不是同质的间质细胞群 体 ，继续传代3 次。 7. 用 H BSS彻底清洗细胞以除去残留血清，消 化 3〜6 代 80%汇合度的间质细胞，用 IOml D l O H G 培养基重悬细胞。 8. 用 2000Rad (20G y ) 的辐射强度照射细胞。将每瓶中的细胞分别接种到6 个装有 B B M M 的 25cm2 的培养瓶中（ 每瓶含约2X IO5 个细胞） ，瓶盖上有气孔。利用间质 细胞做转染（ 基本方案，第 1 步）或作为饲养层细胞长期培养骨髓（ 基本方案，第 30步） 。间质细胞可在照射后两周内使用。 支 持 方 案 5 选 择 培 养 基 和 某 些 成 分 许多用于人的骨髓培养的试剂都对造血细胞有非特异f t 的毒性，尽管它们对其他种 类的细胞生长是可取的。因此，即使是组织培养，也需要最佳试剂成分的浓度。例如， 确定甲基纤维素、 FBS、 BSA、 G418的浓度。 材 料 （ 标V 的 条 目 参 见 附 录 1) 待测的不同剂量的样品 V 甲基纤维素培养基，不含待测成分 CD34+的 祖 细 胞 （ 基本方案，第 10〜15步） 35m m X IOmm方格的培养皿（ Nunc) 1•加入合适数量不同成分不同剂量的待测样品到合适体积的甲基纤维素培养基中以获 得所需要的终浓度。如果细胞没有用适合的载体转染以筛选，不要在培养基中加入 G 418或其他选择性的成分。 2 . 在 3 5 m m X I O m m 方格的培养皿的每个样品孔分配Iml ( 2 倍 或 4 倍）培养基。每孔 加 入 500〜1000 CD34+的祖细胞，混匀。培 养 U d。 3 . 克 隆 计 数 （ cfu; 基本方案，第 3 2 步） 。 G U 8 筛选转染了带有nm 基因的载体的造 血祖细胞时，以未转染或假转染的细胞作为对照。 4•选择最佳的剂量或制剂以获得最大数量的混合谱系克隆。选 择 G 418的最佳剂量使 转染的细胞群形成最大数量的cfu，同时杀死完全未转染细胞。 支 持 方 案 6 从 培 养 物 接 种 克 隆 形 成 细 胞 在间质细胞克隆形成实验中避免污染很重要。尽管经过照射，间质细胞在甲基纤维
    素培养基中仍以较慢的速度分裂。 材 料 （ 标V 的 条 目 参 见 附 录 1) 长期培养的骨髓培养物（ L T B M C )，接种后5 周 （ 基本方案，第 31步）或者转染 后的培养物（ 基本方案，第 23步） Trypsin/versene solution (Bio-Whittaker) V L B M M V 甲基纤维素培养基 用于免疫选择的磁性设备（ 如 M P C -I; Dynal) 25cm2 的培养瓶，瓶盖上带有0. 2^111的 通 气 孔 （ Costar) Beckman GS-6R 离心机和G H 3.7 转 头 （ 或等效的） 35m m X I O m m 方格的培养皿（ Nimc) 1. 用胰酶/乙二胺四乙酸消化接种5 周后的间质细胞层。用吸管剧烈吸打，使细胞团块 散开。如果巨噬细胞内含有免疫磁珠（ 通过吞噬） ，用磁部件除去。 2. 接种细胞到新的25cm2组织培养瓶。孵 育 1〜2h。用培养基温和冲洗附着的细胞层 (勿使培养基直接喷射到细胞层上） ，收集未贴壁细胞，将含有未贴壁细胞的培养基 转移到一个新的25cm2组织培养瓶，孵育1〜2h，弃去前一个培养瓶。 3 . 温和冲洗再次收集未附着细胞。将培养基转移至15rnl 离心管中， 4〇〇g , 室 温离心 5mm。用 Iml LBMM重 悬 沉 淀 并 计 数 （ 附 录 31)。接 种 25 000〜50 000个细胞至 35mmXl〇 mm方格的培养皿，每孔加人添加了补充成分（ 基本方案，第 烈 〜 现 步 ） 的甲基纤维素培养基lml。 如果用来接种的细胞数 太 少 ，可能有以下原因：间质细胞层汇合度 太 大 （ 因此 营 养 被 消 耗 尽 ） ； 换 液 次 数 太 少 （ 当 营 养 缺乏时，祖细胞倾向于分化成巨噬细胞） ； 或 者 在 5 周的培 养 中 使用了 IL_3, IL_3 有驱动早期的增殖和终末分化的作用。因此， 最 好 只 在 转 染 时使用IL-3。 支 持 方 案 7 制 备 单 个 c f u 全 细 胞 裂解液 用 于 pCR 、虽然全细胞裂解的程序更加便捷，以抽提的D N A (支持方案8 ) 为模板的^^尺则 ^ 得 更 _ 敢 _ 结 果 。 P C i m _ 子浓度_ ，酸 雜 藤 液 中 _ 子强度 随原知克，中的细胞数而变化，因此能影响P C R 的结果。 ^ 每一个cfu都是由一个且只带有—个前病毒整合单元的造血组细 可 以采用反向P C R 技 术 （ 支持方案8)。 材 料 （ 标V 的 条 目 参 见 附 录 1) 甲基纤维素培养基培养的Cfu V P B S V R B C 裂解液，仅裂解cfu中的成红细胞 V 全细胞裂解液 IOmgAnl的水溶蛋白酶K (Sigma)第 U 章基因治疗的转移系统 •62
    倒置差相显微镜 20W至 200W无菌的 pipet tips 沸水浴 相显微镜的载物台上。用 2〇 〜2〇 M 无 麵 Pipet如挑取单克 成 细 朐 離 >2〇〇,培养基在2〇 〜 卿 1。每挑—个克隆更换tip。记录含有 成红细胞的克隆（ 它们需要不同的裂解液，第 4 步） 。 FACSVantage (Becton Dickinson W u n o c y t o m e t r y ) T 丁 土 刀 米 。 用 此 法 分 离 单 克 隆 更 加 方 便 ，且 能 交 叉 污 染 。 m 单 元 （ ^ C D U ) 自 动 分 选 到 ％ 孔 板 的 单 个 的 cfu， 细 胞 可 直 接 用 P B S 洗脱 对于一些特殊的细胞，在 96孔板周围的孔加上水，以保持湿度。 2, 室温孵育离 管 中 加 入 Ih 使甲基纤维素溶解。 lm lPB S，将如中吸人的克隆转人其中，并反复吸打冲洗• = ，离心5min。小心移去上清。再次点离，底部可见一三角状的彷 淀物。小心吸去残余液体，留< l〇 y ，防 止 细 胞 丢 失 。可在 一 2〇C 储存。 4. 如 果 克 隆 中 包 含 发 育 中 的 成 红 细 胞 MIX; 基本方案，第 3 2 步） ， 加200^1尺13(：裂解液，用1；叩打勻。 300〇1： /111丨 11离心 2111丨 11。如果沉淀仍有红色，重复 裂解过程。当沉淀变白，用 PBS洗一次。 5.用 2〇 W 全细胞裂解液重悬 沉 淀 。加 2jui 蛋 白酶 K 。 5 6 t ：孵 育 lh。如果 克 隆 较 大 ， (如>2000个细胞） ， 30min后再加2^1蛋白酶K 继续消化。 6•生物裂解lOmin。用 于 P C R 以前将全细胞裂解液储存于—20°C (—般每次反应用 1〜2jul裂解液)。 支 持 方 案 8 单 克 隆 的 整 合 分 析 用反式聚合酶链反应（ P C R ) 鉴定克隆的载体整合模式见图 13. 4. 2 ( 或 Nolta以 < ， 1996)0 材 料 （ 标V 的 条 目 参 见 附 录 1) ’ . 分离的单克隆 V 蛋白酶K 消化缓冲液 10m g /m l 的水溶蛋白酶K (Sigma) , V 25 : 24 : I (V /V /V ) 苯酚/氯仿/异戊醇 20mg/ml 糖原 V l O m o l/L 乙酸铵 100%和 70% (V A O 的乙醇 V T E 缓冲液， p H 7. 5 0 •lmol/L 亚 精 胺 （ Sigma) React 2 缓 冲 液 （Life Technologies) 5U/pJ Tag I 限制性内切核酸酶（ Life Technologies) 5U/jul T4 DNA 连接酶和 5X 缓 冲 液 （ Life Technologies)

    5U/jul ApliTaq D N A 连 接 酶 （ Perkin-Elmer) SeaKem L E 琼 脂 糖 （F M C Bioproducts) NuSieve agarose ( F M C Bioproducts) I X l O 7 Cpm [32P ] A T P 末 端 标 记 的 寡 核 苷 酸 探 针 （ 附 录 3E ) ，标 记 L T R 序歹ij: 5’-G G C A A G C T A G C T T A A G T -3， Circumvent Thermal Cycle Sequencing Kit (New England Biolab) 12〜15°C ， 56〜65°C水 浴 （ 或循环变温加热器应用相应程序） 循环变温加热器和适宜的P C R 管 尼 龙 膜 （ 如 Biotrace; Pall Biodyne) 无 菌 的 解 剖 刀 Spin-X columns (Costar) 1.选择单个的分离较好的cfu。沉淀细胞，裂 解 红 细 胞 （ 支持方案7, 第 1〜4 步） 。用 200^1包 含 l 〇/ xg蛋白酶K 的蛋白酶K 消化缓冲液裂解沉淀（1〇〇 〜 I000个细胞） 。 56°C孵育 2h。 2•用2(%125 : 24 : I (V/V/V ) 苯酚/氯仿/异戊醇抽提裂解物。加 2埤 糖 原 ， 18jLii 10111111〇1/1乙酸铵和5004 100%乙 醇 。一 20°〇 反 应 >2^或 者 干 冰 /乙 醇 混 合 物 中， IOmin0 3. 10 000r/m i n 离 心 5min。除去上清液，用 7〇%乙醇洗沉淀。用 benchtop使沉淀干燥 1〜2h (不要用真空泵） ，用 25^1 T E 缓冲液重悬。 4. 准 备 T a g 工消化混合物： 3W 0. lmol/L 亚 精 胺 ； IOjLtl React 2 缓 冲 液 ； 2M1 5U/ 4 T叫工限制性内切核酸酶； 75jul H 2O 0 加 人 2 4 重悬物， 65°C孵 育 2h 。孵 育 I h 时加入2 ^ T a g I 。 5 . 取 8 4 消 化 的 D N A 加 入 2 4 5 X T 4 D N A 连 接 酶 缓 冲 液 。 56°C 加 热 14min。静 置 15m i n 使 之 冷 却 。加 人 1 4 5U /JU1 T 4 D N A 荜 接 酶 ，在 12〜 15°C 孵 育 2h 。 6. 混合等体积的SOpmol/y i N V a 和 IN V b引 物 （ INVa+ IN Vb混合物） 。混 合 2 体积 的 I O X P C R 扩增缓冲液和3 体 积 25mmol/L M g C l 2 ( P C R 缓冲液标准混合物） 7•准备第一个循环的P C R 反应混合物（ 适用倍增反应， multiply by n+ 1 ) : 5^1 P C R 缓冲液标准混合物； 2mmol/L 4 d N T P 混 合 物 （ 每种 d N T P 终浓度 0. 2mmol/L ) ; 0. 5juJ 5U/jul ApliTaq D N A 连 接 酶 ； 1 4 I N V a + I N V b 混合物。 8.在 PC R管里加人11. 5jlJ 第一轮的PC R 反应混合物。加 36. 5 4 水 和 2^1环 化 D N A (第5 步） ，上层覆盖5〇4矿物油。以下面的程序在循环变温加热器上扩增： 第一个循环： 5min 95°C (变性） 2min 50°C (退火） 4min 72°C (延 伸 ）
    29个循环： Imin 2min 4min 95°C (变性) 50°C (退火) 72°C (延伸) 9. 混合等体积的SOpmol/^l INVc和 I N V d 引 物 （ INVc+ I N V d 混合物） 。进行第二轮 巢式P C R ，除了以2^1第一轮P C R 产物为模板， l^lINVc+ l N V d 混合物为引物外， 反应混合物相同。 10. 2 % (m /V ) 凝 胶 （ l% S e a K e m L E 琼脂糖和l% NuSieve琼脂糖）电泳检测PCR 结 果 （ 每泳道15M1样品） ，将条带转移到尼龙膜，用标记L T R 序 列 的 [32P] A T P 末端标记的寡核苷酸探针杂交（ 附录3G )。 1 1 . 为证实克隆的相同整合模式（ 条带有相似的分子质量） ，以第二轮反应的混合物再 次扩增第一轮P C R 的产物，做 5 管。用 1 % (m A O 的琼脂糖凝胶电泳检测，每 道点样1 5 4 , 共 10道。用无菌的解剖刀小心地切下条带，放 入 Spin-X 柱离心两 次，每次5min，回收琼脂糖中的D N A 。 12. 沉 淀 D N A ，用 8jul T E 缓冲液重悬。以 Ijul反 向 P C R 引 物 I N V c 和 Circumvent Thermal Cycle Sequencing Kit 测序 CNolta. eiaZ.， 1996)。 支持方案9 收获细胞以分析长期的骨髓培养物 每周更换培养基时收集部分长期骨髓培养物（ L T B M C ) 的 细 胞 （ 约 I X l O 6个细 胞/样品） ，沉淀后，用 IOml P B S 洗一次以备抽提核酸或蛋白质做进一步分析。 对 于 R N A 抽提，沉淀用20〇4 P B S 重悬。加 入 4mol/L异硫氰酸胍置于冰上裂解。 裂解前保证细胞团块被打散至匀浆状。由于异硫氰酸胍不能使RNase失活，所以裂解 的同时要防止R N A 降解。含 R N A 溶胞产物抽提前置于一70°C 保存。 R N A 抽提，凝胶 电泳，核酸转染按标准方法（ 见单元10. 3 和附录3G 和 3H )。 对于抽提D N A 以备Southern blot杂 交 （ 附 录 3G )，来源于培养物的非附着细胞 离心后， P B S 洗一次，可以以沉淀的形式储存于一20°C数年，产生的D N A 也足够用于 Southern blotting 或 P C R 0 * 对于抽提蛋白质以备分析，沉 淀 用 10ml P B S 洗 4 次。最后一次离心后，除去 PBS。再次短暂离心，使 15m l 离心管壁上的残留液体集中，用 tip吸去。细胞可以以干 燥沉淀的形式于一7〇° C 保存。即使沉淀残余的IOOjlJ P B S 也会稀释蛋白溶胞缓冲液，影 响酶测定。如果细胞可以在I h 内处理，可置于冰上待用。 支持方案1 0 冻存造血细胞 材 料 （ 标V 的 条 目 参 见 附 录 1) 骨髓，脐带血，外周血细胞 自体血浆或热灭活人A B 血浆 V 冻存培养基， 4°C 2ml 冻 存 管 （ Nalge) 速率可控的细胞冷藏箱
    液氮罐 L 用未稀释的自体血浆重悬骨髓、脐带血或外周血细胞，使密度为4>< 富含C D 34的细胞浓度为IXIO7个细胞/ml。 1-_ / ml。 2- ^ 个 2m l 冻存管加人Iml细胞，在控速细胞冷藏箱冷却到忙前，将冻存管置于冰 相或冰上。 3. 加入Iml冷的冻存培养基混合。将冻存管置于控速细胞冷藏箱，以—rc 、 率冷却。当冷冻循环完成后（ 达到一90。 〇,将冻存管置于液氮&保存 m m 的速 如果没有控速细胞冷藏箱，细胞可放在液氮罐的气相里过右 AL- ^ ^ (此法细胞的存活力略低） 。 然 后 料 到 液 相 支持方案1 1 造血细胞的复苏 材 料 （ 标V 的 条 目 参 见 附 录 1) lmg/ml DNase (Sigma) V 融解用培养基 冷藏保存的造血细胞9 (支持方案10) VPBS 15ml离心管，无 菌 37°C水浴 1•在15m r 离心管中加人IOml融解用培养基和1(%1 I m g/m lDNase。 2 . 快速融解2ml冻存管中冻存的造血细胞，不需离心直接转移到融解用培养基中稀 释。 37°C水浴孵育lh 。 3•用PBS洗两次。 也 可 将 细 胞 直 接 从 冻 存 管 移 入 BBMM培 养 基 中 使 细 胞 团 块 散 开 。此 法 对 大 团 块 的 细 胞 更 适 合 。

    来源：丁香实验

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