L P D 纳米颗粒的制备和输送

L P D 纳米颗粒的制备和输送

材料

试剂

5 X 葡 萄 糖 水 溶 液（26 % m /V ) ，无 菌

将 13 g 荀萄糖溶解在大约 40m l 灭菌水中，然后用灭菌水将体积调到 50m l, 用 0•2 Mm 滤器过滤，室温可保存一年。

D O T A P (25m g / m l 的 储 液 ) ，溶 解 于 氯 仿 中 (AvantiPolarLipids)

DOTAP (1, 2-二油酰基-3-三甲基氨基丙烷）是最为广泛使用的用于基因传递的阳离子脂质材料之一。一 些 电 中 性 脂 质 材 料（如 DOPE、 1, 2-二油酰磷脂酰乙醇胺、胆固醇）可以用于提髙转基因效率。

胆 固 醇 的 氯 仿 溶 液（20m g /m l ) (Sigma-Aldrich)

体内使用时，胆 固 醇 可 以 替 换 D O P E , 作 为 辅 助 脂 ，生 成更为稳定有效的阳离子脂质体(LietaI. 1998 ) 。

溶 解 于 去 离 子 水 的 质 粒 D N A (l m g /m l )

质 粒 D N A 应该经高度纯化并且不含内毒素。推 荐 用 水 或 5 . 2 % 的 葡 萄 糖 溶 液 稀 释 DNA,因为盐干扰 D N A 和阳离子脂质体的相互作用，并发生团聚。

硫 酸 鱼 精 蛋 白（l 〇 m g/m l， E lkins-Sinn)

硫 酸 鱼 精 蛋 白（MW 4000〜4250)，富含精氨酸的阳离子多肽，在 L P D 中 用 于 和 D N A 相互作用。 Im ol 硫酸鱼精蛋白含有 21mol 正电荷，与 D N A 分子具有很强的相互作用。

灭 菌 水

121°C 蒸 汽 灭 菌 30 min。

仪器

超 声 水 浴

Corex 玻 璃 试 管（30m l )

LiposoFast 挤 压 器 ，带 I m l 注 射 器（Avestin)

氮 气（N 2) 钢 瓶

聚碳酸酷薄膜滤器（l. 〇 M m 、 〇.4f x m 和 0 • l) n m ， C o r n i n g 公司）

聚乙烯离心管（50m l )

真空干燥器

方法

阳离子脂质体的制备

1.用氯仿将 30m l C o r e x 玻璃试管冲洗 3 次。残余氯仿可以不吹干

2 . 在玻璃管中将〇 • 8m l D O T A P 储液和〇.55m l 的胆固醇储液混合。

目前，我们实验室按摩尔比 I : 1 混 合 D O T A P 和胆固醇制备阳离子脂质体。由 1 鸿的质粒D N A 和 含 3 6 _ 1 D O T A P 和 36_1 胆 固 醇 的 阳 离 子 脂 质 体 制 备 的 Iip0pIex 的电荷比为 12 : 1( + : —）。

3•在化学通风橱里，转动玻璃管的情况下，沿管壁导入氮气，使得氯仿挥发，并在玻璃管底部形成一层薄膜。可将玻璃管置入 35°C 水浴，以加速该过程。

4 . 将玻璃管置于真空干燥器 2〜3 h 使其完全干燥。为防止脂质膜在真空环境下损失，可用铝箔盖上玻璃管，同时用针头在箔片上刺一些小孔。

5.在玻璃管中加人 2m l 灭菌水。

6 . 以最大速度涡旋 15s 以重悬脂质，直到管壁没有脂质残留，也没有白色沉淀为止。重悬浮时，可将玻璃管在超声水浴中间断超声几次（1 〇〜l5s)。

7•将重悬液于室温下放置 2〜3 h 或者 4°C 过夜培养，使得脂质完全水化。水化时间越长， 脂质体越容易被挤出。推荐过夜水化。

8•涡旋悬浮液，并 在 65°C 水浴中培养 5〜l O m i n。如果观察到脂质聚集，要将重悬液置于超声水浴超声处理直到聚集消失，然后重新放回水浴中。

9.将两张 I.O p m 的聚碳酸酷膜放在挤出机里。

10•将挤出机加热到 65° C ，维 持 5m i n 。

加 热 脂 质 悬 浮 液 和 挤 出 机 到 65°C ，是 为 了 维 持 脂 质 液 态 ，方便挤出并提髙脂质混合的效率。

11.将悬浮液通过滤膜挤出，重 复 5 次。把挤出机放回水浴中。悬浮液经挤出后，从混浊变成半透明状。

12•连续使用 0. 4um和 0.1um 的聚碳酸酯滤膜重复步骤 9〜11，获得平均粒径在 1 〇〇〜200n m 的脂质体。

阳离子脂质体悬液在 4°C 可以稳定存在几个月。

I i p o p l e x 的制备

13•在 50m l 离心管内加人 60ul 5 X 葡萄糖溶液、 154ul 灭菌水和 86ul的阳离子脂质体，中 速 涡 旋 10s。

脂质体和质粒 D N A 在温和条件下混合以得到脂质复合物。终 体 积 600ul 的 溶 液 中 含 100ug质 粒 DNA。需要大量制备时，体积和质量按比例加大。

14.在 1.5m l 离心管中加人 40ul l5X 葡萄糖溶液、 60ul 灭菌水 和 100ul质 粒 D N A ，轻拍离心管以混合。不要涡旋。

15.在轻轻涡旋稀释脂质体悬液的同时，逐滴加人稀释的 D N A 溶液。用 10 〇〇 ul 移液器枪头转移液体；加 入 200ul D N A 溶液需要 5〜10s。

16.注射前，室温下培养复合物 1 〇〜I5m i n 。

L P D 的 制 备

17•在 50m l 离心管内加人 60u; 1 5 X 葡萄糖溶液、 148ul 灭菌水和 86ul 的阳离子脂质体，和 6ul硫酸鱼精蛋白溶液，中速涡旋 l 〇 s。

LPD 纳米颗粒的最佳组分是 12n m ol 的 DOTAP/12n m ol 胆固醇/0• 6ug 硫酸鱼精蛋白/I ug质 粒 DNA, _ DO TA P 和 D N A 的电荷比是 4 : 1, 鱼精蛋白和 D N A 的电荷比是 1 : 1。

18• 在 1.5m l 离 心 管 中 加 入 40M 1 5 X 葡 萄 糖 溶 液 、 60ul 灭 菌 水 和 IOOfJ 质 粒 D N A ，轻拍离 心 管 以 混 合 。不 要 涡 旋 。

19•在轻轻涡旋稀释脂质体-鱼精蛋白溶液的同时，逐滴缓慢加入稀释的 D N A 溶液。

用 IOOOul移液器枪头转移液体；加 人 200ul D N A 溶 液 需 要 5〜10s。 L P D 纳米颗粒通常在使用前即时准备。然 而 ，在 4°C 条 件 下 L PD 至少可以储藏 4 周 ，而不影响活力。 LPD 也可以冻干成粉末，并在室温条件下至少可以储藏一年，重 悬 后 活 力 不 降 低（L ie ta L 2000)。

20•将 L P D 在室温培育 10〜15m i n 后注射到动物合适的部位。

2 1•用合适的方法检测 D N A 的表达。