改 良 了 趋 向 性 的 麻 疹 病 毒 的 拯 救 和 增 殖

改 良 了 趋 向 性 的 麻 疹 病 毒 的 拯 救 和 增 殖

材料

配体的可读框时应特别小心（图 1)。

为 了 有 效 地 拯 救 ，基 因 工 程 产 生 的 麻 疹 病 毒 基 因 组 长 度 应 该 是 6 的 倍 数（hexamericlength)。我们因此构建了两个穿梭载体，它 们 在 H 蛋 白 m R N A 的非编码区包含或是不包含 一 个 3b p 的片段的删除，依 赖 含 有 一 个 奇 数 或 偶 数 的 氨 基 酸 的 配 体 ，分 别 用 PTNH6-Haa (偶数）或 pTNH6-Haa (奇数） 质粒。

2.将编码嵌合 H 蛋白的 P a d / S 扣 I 消化片段插人到全长麻疼病毒基因组的 c D N A 克隆的 p (+) M V e G F P 的位点。

摆救病毒的转染

3.在转染前一天，胰酶消化收集培养在 I O O m m 平皿中的已融合的 293-3-46 细胞，并在重悬在 12m l 含 有 I.2m g / m l G 418 的完全培养液中。

4.6 孔板的每一孔中加入 2m l 重悬的细胞， 37°C 孵育 20〜24 h 。
进行转染时，细胞的汇合度应为约 8 0 % 。

5•在转染前 3〜6 h , 将 6 孔板的细胞培养液吸出，换 成 2m l 不 含 G 418 的完全培养液。

6.分 装 250M 12 X H B S 放于一无菌管中。

7.在第二个无菌管中，将 5M g 重组的全长的麻疹病毒 c D N A 同 5〜50 g/L 表达载体p E M C -L a 混合，加人水至总体积 225ul。

8.加入 25ul2. 5m o l / L CaCl2 到 D N A 溶液。

9•边搅拌边逐滴加人 D N A 溶 液（步骤 8 ) 到 2X H B S (步骤 6)。

10.将混合溶液室温下孵育 30m i n ，涡旋混勻。

11•立即逐滴将溶液滴加到 6 孔板的 293-3-46 细胞中。 37°C 孵 育 14〜16 h 。

12.将转染培养液换成新鲜的不含 G 418 完全培养液。

13•将转染后的 6 孔板用封口膜包住。 43. 5°C 水 浴 3 h 以诱导热激。水浴完毕后继续置于 37°C 培养箱中培养直至收获细胞。

14.在覆盖前一天（如转染后 48 h )，用胰酶消化，收集 V e r o-a H i s 细胞。

15•将 V e r o 细胞转移到 I O m m 的培养皿中，使浓度达到 I.5 X 10⁵〜2 X 10⁶ 个/孔。然后加人含有 G 418 的完全培养液。 37°C 孵 育 14〜16 h 。转染时细胞的汇合度应约为 7 0 % 。

16.转染后 72 h ，用吸液管吹打细胞以分散细胞，并将单层细胞分散成小块。将分散的细胞于 5m l 的培养液中。不要使用细胞解离剂。

17.将 293-3-46 细胞悬液覆盖在 I O O m m 培养皿中培养的 Vero-aH i s 单层细胞中。 37°C孵 育 2〜7d 。

几个感染中心可被观察到多核的合胞体，在荧光显微镜下可以看到绿色荧光表达量升高。拯救病毒后的增殖

18.在转移收获的病毒斑前一天，通过胰酶消化收集 V er 〇-aH i s 细胞。

19.将 V e r o 细胞转移到 6 孔板，使浓度达到 2 X IO⁵ 个/孔。然后加人含有 G 418 的完全培养液 2m l 。 37°C 孵 育 14〜16 h 。