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    基本方案3 将外源基因序列插入到复制缺陷性基因组人类单纯疱疹病毒（HSV)载 体

    相关实验：构建复制缺陷型疱疹单纯病毒载体实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    IE 基因补充细胞 复制缺陷性 HSV 载体 带外源基因的质粒 在24孔板中单层培养IE基因补充细胞系
    完全改良的基础培养基 三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水 DNA 抽提缓冲液 苯酚 氯仿 异戊醇 氯仿 异丙醇 乙醇 总 RNA 分离试剂 1-溴-3-氯丙烷 核糖核酸酶 反转录酶及其缓冲液 DTT 外源基因引物对 三磷酸脱氧核苷混合物 胎盘 RNA 酶抑制剂 灭菌水 10 X PCR 扩增缓冲液
    外源基因序列的 DNA 探针 Taq DNA 聚合酶 摇床 组织培养皿 96孔平板及24孔组织培养板 微量离心管 研磨杵

    步骤

    1. 将经Pac I 酶切的复制缺陷型H S V 载体与含外源基因的线性化质粒共转染IE基因 补充细胞培养。在 96孔平底组织培养板中分离出单个斑点。 （ 基本方案2 , 第 1〜18 步)。 2. 从每个板孔中转移80W 培养基到一个新的％ 孔板。将新板保存于一80°C (病毒株） 。 3. 在每个板孔中将剩余的2〇W 培 养基（ 含病毒）与 IOOjuI完全培养基/10% F B S 混合。 从 IE基因补充细胞的培养板孔从吸取培养基到一个24孔板，并加入120jul含病毒的 培养基。孵育60〜90min，每隔15min摇晃一次培养板以保证接种物平衡分布。 4 . 吸附反应后，抽吸接种物，然后加入Iml新鲜的完全M E M /10%F B S 培养基。孵育 2〜3d。检测培养物并以细胞变圆作为细胞病变效应（C P E ) 的 证 据 （ 基本方案2, 第 11步)。 5. 用微量移液器tip刮擦每个孔单细胞层，转移悬浮液至1.5m l 微量离心管。室温下以 最大超速离心IOmin以沉淀细胞及病毒。 6. 小心吸取上清液，用 50(V l p H 7. 5 T B S 洗沉淀。以最大超速离心5m m 以沉淀细胞及 病毒。抽吸上清液。 7. 用 200p l D N A 抽提缓冲液重悬沉淀。 37°C 摇床孵育过夜。 8. 2004 25 :24 : 1 苯酚/氯仿/异戊醇抽提溶胞产物。剧烈涡旋混合两相。 9. 室温下以最大超速离心5m i n 以分离两相。去 除 下 层 （ 有机）相，保留上层水相及 界面。 10. 20〇4氯仿抽提水相。颠倒混合两相。室温下最大超速离心2min以分离两相。转移 上 层 （ 水相）至新试管。 由于D N A 极端黏稠，将呈可见的黏液吸入吸量管。 11. 力卩 500W —20°C 异丙醇沉淀病毒D N A 。室温下以最大超速离心15min。小心抽吸上 清液。 12. 用 500^170%乙醇洗沉淀，颠倒。离心5min。抽吸上清液，自然晾干。 13. 50jul水重悬沉淀。使用插入外源基因序列特异性D N A 探针进行斑点印迹或Southe m blot杂 交 （ 附录3G ) 以分析病毒D N A 。 14. 取 IXlO5 IE基因补充细胞种植至30m m 组织培养皿。孵育过夜。 （ 孵育后板子从非 汇合到汇合） 15. 抽吸培养基，加人含IXlO7Pfu含外源基因重组病毒（ 第 2 步； M O I = IO; 见病毒 滴度测定）50〇4无血清M E M 培养基。孵 育 60〜90min，每隔15min摇晃一次皿 以保证接种物平衡分布。 16•吸附反应后，抽吸接种物，然后加入2m l 的完全M E M /10% F B S 培养基。孵育 12〜16h〇 17. 每个皿中加入0.8ml T R I 试剂溶解细胞。刮擦皿并转移细胞溶解物至一无菌1.5ml 的微量离心管中。匀浆器使溶胞产物均匀化，并在室温下孵育5min。 18. 在溶胞产物中加入0.1ml B C P , 涡旋15s。室温孵育2〜3min。 19.室温以最大超速离心15min，转移上层（ 水相； R N A ) 到一个新的1.5m l 离心管。 20. 加人0.5ml—20°C 异丙醇沉淀R N A ，室温孵育lOmin。室温最大超速离心lOmin。
    21- 7 0 % 乙醇洗涤R N A 。室温最大超速离心5min。抽吸上清液并自然晾干。 22-50jul水溶解抽提的R N A 。加 1000U 核糖核酸酶-胰脱氧核糖核酸酶I破 坏 D N A 模 板 37°C 娜育 60min。 23. 75°C 孵 育 IOrnin使酶失活。准备R T -P C R 分析缓冲液（ 每次反应20juD: 5X Superscript II缓冲液； 2ixl I.Ommol/L D T T ； Ijul lOOng/^1外源基因，乳糖操纵子Z 或 G A D P H 阳性细胞对照； Ijul 10mmol/L 4dNTP 混合物； Ipl lOU/jul Superscript II反转录酶； 5“ R N A 样品； 5jul无菌水； 3 7°C鮮育 3Omin。 24. 准备P C R 分析缓冲液（ 每次反应8〇4): 10/ul IOXPCR 扩增缓冲液，含 15mmol/L M g Q 2; V l 10mmol/L 4dNTP 混合物； IjlJ lOOng/W 外源基因，乳糖操纵子Z 或 G A D P H 引物对； Ijul 10U /V 1Tag D N A 聚合酶； 64/J 无菌水。 25•加入P C R 分析缓冲液使R T -P C R 反应体积达IOOjLJ。按下列程序扩增： 30个循环 Imin 95°C (变性） Imin 60°C (退火） IOmin 71。 (： （ 延伸） 26•以外源目的基因，乳糖操纵子Z (阴性） ，或细胞因子对照GAi3D H 的特异性D N A 为探针通过Southern blot杂交分析R T -P C R 反应产物。 以材料列表中的引物扩增的GARDH及 ^ c Z 片段长度分别为614bp及 324bp。 如果外源基因插入到载体中，则 ZacZ片段应该不能检测到。 支 持 方 案 1 单 纯 疮 疼 病 毒 系 的 制 备 材 料 （ 标V 的 条 目 参 见 附 录 1) 适合于病毒生长的受体细胞 已知滴度的病毒株（ 支持方案2) 公完全改良的基础培养基/10% (W V ) F B S 及无血清培养基（ 完 全 M E M /10% F B S 及完全M E M ) lmol/L H E P E S (N -2-羟乙基哌嗪-2-乙磺酸） 25cm2 组织培养瓶 15m l 及 50m l 圆锥形聚丙烯离心管 Beckman G P R 制冷台式离心机及G H 3. 7 浮桶式离心机 Cup-horn 超 声破碎器（ VirTis)
    50m l 聚丙婦O a k 离心管 Beckman J2-21M 制备离心机和JA-20转 子 （ 制备） 850cm2组织培养滚瓶 滚子摇瓶装置 ， 细胞刮棒 1. 种植L O X l O 6个受体细胞于25cm 2 组织培养瓶。孵育 1〜2d (直到细胞活性分裂） 。 2. 转染当天，从单层细胞抽吸培养基。加入含3XlO4Pfu 病 毒 （M O I = 0 . 0 1 ) 的 Iml 无血清M E M 培养基。孵育60〜90min使病毒吸附于细胞上，每 隔 15min摇晃瓶子 以保证接种物平衡分布。 3. 抽吸接种物，加人10m l完全M E M /10%F B S 培养基。孵育直至所有的细胞显示细 胞病变效应（CPE)。例如，聚集并开始从瓶底脱落；每天检测细胞两次。 4. 通过轻叩或刮擦瓶底移去细胞。转移细胞悬液到15m l 圆锥形聚丙烯离心管中。 4°C ， 1500g■离心5min〇 5. 将上清液移至新试管中， 4°C 短时保存。用完全M E M /10% F B S 培养基重悬沉淀使 终体积为lml。 6. 冷 冻 （ 一80°C ) 及 溶 解 （37°C ) 转染细胞悬液3 次。用 Cup-horn超声破碎器高频声 波分裂混悬液5s， 4°C 2000g 离心5min沉淀碎片。 7. 将上清液与保存于4°C 的上清液（ 第 5 步）混合，转移至50m l 聚丙烯O a k 离心管。 4°C 48 OOOg离心30min沉淀病毒。 8. 小心抽吸上清液，以完全M E M /10% F B S 培养基重悬沉淀使终体积达lml。测定病 毒的滴定度（ 支持方案2)。 9. 将病毒制品分装至2m l 冷冻管，保存于一80°C 备用。 10.在两个850cm2 滚瓶中分别种植2. OXlO7个受体细胞。孵育1〜2d。 11. 转染当天， f顷倒瓶中的培养基。每个瓶中加入含I X IO6 pfu病 毒 （M O I = 0.01) 完全无血清培养基20ml。使病毒在滚瓶装置中37°C 吸附60〜90min。 12. 吸附反应后，倒出接种物，每瓶加入1〇〇〜125m l 完 全 M E M /10% F B S 培养基。 37°C 孵育至所有细胞聚集并从表面分离。每天至少观察细胞两次以获取准确的收获 时间。 . 13. 用细胞刮移去滚瓶表面的细胞。将混悬液移至50m l 圆锥形离心管。 4°C ， 1500g离 心 5min沉淀转染细胞。 14. 将上清液移至新试管， 4 C 短时保存。兀全M E M /10% F B S 培养基重悬沉淀物使终 体积达2ml。 15 . 冷 冻 （ 一80°C ) 及 （37°C ) 转染细胞3 次，注意防止试管爆裂。用超声破碎器处理 混悬液5s， 4°C ， 2000g 沉淀细胞碎片。 16. 将上清液与4°C 保 存 的 上 清 液 （ 第 I4 步） 。转移至冰上50m l 聚丙烯〇ak Ridge试 管。 4°C， 48 OOOg 离心 30min。 1 7 . 小心抽吸上清液。完全M E M /10%F B S 培养基重悬沉淀物终体积达i 〜2mi。 分装 lOOjul到 2m l 试管中一80°C 保存。 减 少 传 代 次 数 以 避 免 缺 失 必 需 基 因 的 病 毒 增 殖 过 程 中 野 生 型 病 毒 的 增 殖 机 率 。
    18. 测定病毒株的滴定度（ 支持方案2)。 1 9 . 任意：为了进一步纯化病毒， P B S 重悬沉淀，蔗糖、 T -1 0 葡聚糖或Nycodenz梯度 纯 化 （ 如 C P M B U N I T 16.11)。 储存前加入1 0 % 的甘 油 。 蔗 糖 梯 度 纯 化 是 用 线 性 3 0 % 〜 6 5 % 梯 度 ， 4°C ， 71 OOOg 离 心 16h D 支 持 方 案 2 噬 菌 斑 分 析 测 定 病 毒 滴 定 度 本分析试验需重复2 或 3 次。 材 料 （ 标V 的条目参见附录1) 适合于病毒生长的受体细胞 用于滴定的病毒株 V 完全改良的基础培养基/10% (V /V ) F B S 及无血清培养基（ 完全M E M /10% F B S 及完全M E M ) V l % W V ) 甲基纤维素 V I % W V ) 龙胆紫溶液 12孔组织培养板 1. 将 I.O X l O 5 个受体细胞种植于1 2 孔组织培养板中。孵育过夜直至细胞形成几近汇 合的单层细胞。 2. 第二天，制备含10倍稀释浓度（K T 5〜10-ltO 病毒Iml完全无血清M E M 。将双份 1(%1稀释液到受体细胞孔中。 37°C 孵育60〜9Omin使病毒吸附，每隔l5min 摇晃一 次板子4 种植物平衡分布。 3. 吸附反应后，抽吸病毒接种物。加人Iml 1.0%甲基纤维素覆盖。孵育3〜5d 直到界 限清晰的斑点出现。 4. 当斑点清晰可见时，抽吸甲基纤维素。用 Iml 1 % 龙胆紫室温染色5m m 。 5. 抽吸染液，用自来水轻柔冲洗板子去除过量的染色液。自然晾干。 6 . 计算每个孔的斑点数。确定每个稀释孔中斑点的平均数，乘 以 10得到各个稀释孔 每毫升斑点形成单位数。这个数值在乘以10到稀释倍数得到病毒株每毫升噬斑形成 单 位 （pfu/ml) 的滴定度。 支 持 方 案 3 分 离 病 毒 DNA 病毒D N A 的转染性是通过计算病毒D N A 转染进人受纳细胞后每微克病毒D N A 产生的斑点数的比率来衡量。纯化病毒D N A 使每毫克纯化的病毒D N A 100〜1000个 斑点。 材 料 （ 标V 的条目参见附录1) 单层受体细胞，培养于150cm2组织培养瓶及60m m 组织培养皿 已知滴度的H S V -I 病 毒 株 （ 支持方案1) V 兀全改良基本培养基/10% F B S 及天血清完全改良基本培养基（ 完全]yiEM/10% F B S 及完全无血清M E M )
    八三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS), p H 7. 5 V D N A 抽提缓冲液 725 :24 : I (V /V7V ) 苯酚/氯仿/异戊醇 氯仿 异丙醇，一20°C 7 0 % 乙醇 标记总H S V ~1病毒D N A % (m /V ) 甲基纤维素 % (m /V ) 龙胆紫溶液 150cm2组织培养瓶 细 胞 刮 （ 任选） 15m l圆锥形聚丙燦试管 Beckman G P R 制冷台式离心机及GH-3. 7 浮桶式离心机 摇 床 （ 如 N utator、 BectonDickinsonPrim aryCareDiagnostics) 热封闭巴斯德吸管 宽口移液管 Tip (B10-Rad) 1 . 吸取 150cm2 组织培养瓶（ 约 L 7 x i 0 ?个细胞）中从非汇合到汇合生长单层细胞 养基。 在 转 染 前 3 d 和 前 1 天 细 胞 应 该 1 : 2 传 代 ， 以 确 保 细 胞 是 快 速 增 殖 。 细 胞 的 选 择 应 该 根 据 它 是 需 要 ， 去 互 补 必 需 的 正 基 因 缺 失 突 变 还 是 多 基 变 ，或 者 是 野 生 型 病 毒 。 2 . 细胞接种在5m丨无血清完全培养基， 5.0X l 07pfu 病 毒 （ MOI= 3 ) 转 染 ， 37。 c 孵， 60〜9〇 m m ，每 15min摇动培养瓶一次，使接种物分散均匀。 3. 感染完^ 后 ，、吸去接种物，加 人 2〇 m l完全培养基M E M (含 1〇% FBS)。 孵 育 18, 24： 1^定 时 检 测 C P E 的 形 成 （ 以细胞变圆但仍然贴壁为标准） 。 4. 剧 烈拍打培养瓶或者用细胞刮，收集细胞。转移细胞悬液到;iSm l 离心 4°C离 心 5〜 lOmin。 ^ 5. 去除上清液， 5ml TBS ( p H 7.5)重悬。 6. 汇 集两管5m l 悬液到— 个管子， 1 5 0 0 〜 2 0 0 0 g ， 离 心 5 〜 1 〇 m m 。 7. 加 5m l D N A 抽提缓冲液，上下颠倒数次重悬细胞， 37。 〇摇床孵育过夜。 重 要 ^疋 示 ：不 要 振 荡 细 胞 悬 液 ， 以 防 止 破 坏 病 毒 D n a 。 ^ 酔二氯仿：异 丙 醇 为 奶 9•室/ 血 2000g 离 心 5min，弃去下层有 ：M 机相， : 1 的混合液，轻柔颠倒混勻，不 鎌 荡 。 保留中间层。 1H r 离H 轻柔颠倒混勾，室 温 2〇 o〇 g 离 心 5酿 ，转移尽可能多的水相到新白 病毒D N A 在 中 间 层 ，十 分 黏 稠 ，在 移 取 时 会 呈 泥 浆 状 黏 在 移 液 器 上 1L 丽 ，混 勻 后 職 ■ 出 ^ 的 D N A 转 移 沉 淀 物 麵 的 旧 D N A 离心管 。腦 封 口 。 撕 巴斯德管 _ 斯 ‘ 缠 绕 ，舰 有 d n a D N A白 那一& 保留在离心管中，过夜风干D N A ， 宽 口 的 Tip加 lml水重悬。
    12. 260nm、 280nm紫外分光光度计测量D N A 浓 度 （ 附录3D; 纯的制备物在八 26 。/28。>1.7)。 13. Southern杂交时，用几种限制性内切核酸酶酶切I jug病 毒 DNA, 琼脂糖凝胶电泳 分离酶切产物（ 附 录 3G)。应用 附 录 3G 中描述的条件进行转膜和杂交，当利用 HSV-I 病母D N A 为探针检测病毒DNA完整性时除外。 14. 取I y g 由第11步得来的病毒DNA，在 60m m 培养皿中转染受体细胞（ 基本方案2, 第 1〜10步，跳过质粒共转染这一步） 。 小心加入4m l 完全培养基M E M (含10% FBS)，孵育 24h。 15•转染后的第一天，去除培养基，加入3m l l % 的甲基纤维素溶液。孵育并定期检查 特征性噬菌斑的形成。 16. —旦噬菌斑形成，吸去上层，加 人 2m l l % 结晶紫染液。室温孵育5min，吸去染 液，流水冲洗，风干。 17•计算每平板的噬菌斑数目，计算每个每m g D N A 所形成的噬菌颗粒的数目。 好 的 产 物 为 每 毫 克 D N A 形 成 100〜1000个 噬 菌 斑 。

    来源：丁香实验

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