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    基本方案 短暂转染的假包膜反转录病毒的制备

    相关实验：假包膜型反转录病毒载体的制备实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    反转录病毒载体 质粒
    293GP 和 NIH3T3 细胞的培养物
    超速离心机 细胞培养皿 聚丙烯管 灭菌无热原的注射器式滤器 超干净的离心管 宽嘴离心瓶 超速离心机 G S A 转子

    步骤

    1•克隆（ 单 元 12. 4 ) 目的基因进入修饰的反转录病毒载体如图12. 5.1所示，用 C M V I E 启动子代替V L T R 的 U 3 区。2 . 用 Beckman polyallomer (聚丙烯和聚乙婦的聚合物）高速密封离心管和vTi 50转子 的超速离心机，氯化铯法提纯包含目的基因的病毒载体后，再用碱裂解法纯化。 3. 转染之前的24h ，接种IXlO6 293GP细胞于IOml完全DMEM/10% FBS的 IOOmm 细胞培养皿中。孵育。 4. 转染当天，在灭菌的6m l的聚丙烯管里混合20哗氯化铯纯化的病毒载体D N A和 2(V g p C M V -G ，它包含C M V I E 启动子控制的V S V -G 基因。用 T E 79/10调整体积 到437卩1。 5. 加 63W 2 3mol/L CaCl2并混匀，然后加5(%1 2X He B S 并持续搅
    6.室温静置30m in使 形 成 磷 酸 钙 七 +m、 5〇 % 汇合■ ■ 养 显 （ 70% ^ 物 。把沉^ _ A 2 9 3 G P _ 至少达到 的） ，孵 育 8 h 。 S〇 /q 是理想的，细胞密度对病毒制备是至关紧要 7. 以 6tnl新鲜的 D M E M / i O % F B S 换液 8 . 在转染后的24〜96h，收集培养基卜 并于一7〇T：储存。 上凊液，使用灭囷的〇. 注射式过滤器过滤， 因 为 V S V -G 的 过 量 表 达 ，在 姑 逃 ^ 对 脱 I 絲 在 细 航 亡 变 大 量 ， ^ 并 从 细 胞培养 a a u 、主、、此 、 undefined u ^土a 你士 1 、之目’ 在转k 后 24： h ，可月匕收获而滴度的病毒 ， 上^ 能， ^ 收” 到 軸 在 皿 上 的 转 染 细 胞 < 3 Q % 。为了要更进一步丙增母加 ^ 和 细 胞 换 液 期 间 不 扰 乱 那 些 黏 附 不 好 的 母 间 隔 处 收 集 一 次 ，达 到 293G p 细 胞 。转 - 天 3 次 。 然 而 重 要 的 是 在 病 毒 大 量 的 细 胞 损 失 。 对于假包膜反转录病毒载体的小量（ 〈 i 00mi) 收集 9a. 在 W C 薩 冻 存 的 病 毒 ，冑 移 到 如 ^ 的 麵 誠 层 流 通 风 橱 紫 外 线 灭 菌 过 細 Beckman超净离心管里。以 50 〇〇〇g ，代 离 心 9〇min。 l〇 a•在层流通风橱弃去细胞上清液。用 〇.5% 〜 1 % 最初体积的DMEM/1〇 % F B S 或 0. I X H B S S 重悬病毒颗粒， 4°C 。温和的用吸移管分散病毒聚集物。孵育过夜。 lla. 分装病毒L 一 70°C保 存 （通常有传染性的病毒<5〇%复 苏 的 ） 。 为 进 一 步 提 高病毒 滴度，进行第二个超速离心步骤（ 已经被证实滴度可高达109c:fu/ml)。 对于假包艇反转录病毒载体的大量收集 9b. 在 37° C 融 解 冻 存 的 病 毒 ，转 移 到 灭 菌 的 250m i 宽 嘴 离 心 瓶 。 4〇c ， 13 〇〇〇g_ (9000r/min用 G S A 转子）离 心 15h 以沉淀病毒。 10b. 4°C 重悬病毒颗粒。温和的用吸移管分散病毒聚集物。孵 育 4h。 llb. 分装病毒，一7〇°C 保 存 （ 通常有传染性的病毒是复苏的2 0 % 〜4 0 % ) 。 1 2 . 转染前 2 4 h , 每 I O O m m 细胞培养皿2 X I O 5 的密度接种鼠N I H 3 T 3 细胞在D M E M / 10% F B S 中。 13. 0 •1、 1 和 IOjbJ 收获的病毒传染细胞在含“ g/m l 聚凝胺培养基中。孵育过夜。 14. 换新鲜的D M E M /10% F B S 培养基并加80(V g / m l 的 G 418。 每 3d 重复1 次。 15.感染后两个星期， 1〇〇%甲醇固定G 418抗性克隆lOmin， 0 . 0 4 % 吉姆萨染色液染色 lOmin，计数。用 G 418抗性克隆的数目乘以对应稀释倍数确定未稀释病毒原种的 滴度，表示成cfu/m l。 备 选 方 案 来 自 稳 定 包 装 细 胞 的 假 包 膜 反 转 录 病 毒 的 制 备 这个方案对假包膜反转录病毒载体的大量制备是有用的。 附加材料（ 基本方案；标V 的条目参见附录1) 双向性包装细胞株PA317的培养物 包含目的基因和neo 基因的反转录病毒载体 V 80m g/m l潮霉素
    lmg/m l 曝呤霉素 ^/lmg/m l 四环素 N^ OOjamol/L 的 P 雌二醇 6 孔 和 24孔细胞培养板 1. 转染前24h ，按每100m m 细胞培养皿l X 106的密度接种P A 317 细胞在D M E M /10% F B S 中。孵育。 2. 转染细胞用20Mg 包含目的基因和„eo选择基因的反转录病毒D N A (基本的方案，第 4〜7 步)。 3. 转染后48h ，收获病毒， 0.45jum注射式过滤器过滤，并于一70°C: 保存。 从 P A 3 1 7 细 胞 短 暂 转 染 产 生 的 病 毒 载 体 滴 度 取 决 于 反 转 录 病 毒 的 结 构 ， Io2〜 103cfu/ml〇 4. 反转录病毒感染前24h ，按 每 I O O m m 细胞培养皿2 XIO5的密度接种293G P /G~21细 胞在D M E M / 10%F B S 中，力 n 800m g /m l 的潮霉素， lmg/m l 的嘌呤霉素和2mg/ml 的四环素。 5. 用 第 3 步收获的双向性病毒传染第4 步描述的293G P / 0 2 1 细胞，加 4m g /m l 聚凝 胺在培养基中。感染后24h ，用 第 4 步描述的培养基加800mg/ml G 418给细胞换液。 6•每3d 用 第 4 步描述的培养基加800mg/ml G 418给细胞换液。 7. 筛选两周后，用自动移液器挑GA18抗性克隆接种接到2 4 孔细胞培养板，然后从24 孔接种到6 孔细胞培养板，再然后是I O O m m 细胞培养皿如果需要的话。 8 . 为了识别高滴度的病毒产生克隆，诱导病毒产生前24h ，按 每 I O O m m 细胞培养皿 2X 106 的密度接种这些细胞在D M E M / 1 0 %F B S 中，加 800m g /m l 的潮霉素， Img/ m l 的嘌吟霉素， 800mg/ml G 418和 2m g /m l 的四环素。 9. 诱导的当天，用 10m l D M E M /10% F B S 换液。为了要除去残余的四环素， 37°C 至少 孵育细胞30min并再一次用新鲜的D M E M /10% F B S 换液。重复这一步骤三次。 10. 为了要诱导病毒产生，把 2mmol/L 的浓度卩-雌二醇加入10ml D M E M /10% FBS。 11. 加卩-雌二醇后72h ，收获病毒培养物上清， 0.45p m 注 射 式 过 滤 器 过 滤 。确定 N I H 3T 3细胞病毒滴度（ 基本方案，第 12〜1 5 步）。 12. —旦高滴度生产克隆被分离，接种，洗并诱导如第8〜1〇步所描述的，生产细胞将 大量产生病毒。卩-雌脂二醇诱导后48h ，可以一天三次收集病毒培养物上清液，持 续达两周并可超速离心收集的培养基以进一步浓缩病毒（ 基本方案，第 如〜Ila或 9b〜Ilb 步） 。

    来源：丁香实验

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