HSV/A A V 杂合扩增子载体的构建和包装

HSV/A A V 杂合扩增子载体的构建和包装

材料

试剂

细胞： V e r o 细 胞（clone 76， E C A C C 85020205) 和 V E R O 2-2 细 胞（ Smith etal. 1992)

干冰

DMEM (Invitrogen)

乙醇

胎 牛 血 清（ FBS 2% 、 6 % 或 10%)

G418 (Geneticin；Invitrogen, 11811-031)

H A N K 缓 冲 液（H B S S ; G I B C O B R L )

Lipofectamine 试 剂 (Invitrogen)

质粒

HSV/AVV 杂合扩增子质粒（pHSV/AAV; H eisteretaL 2002)

包装缺陷型的H SV -I辅助病毒DNA (Saeki et al. 2001)

fHSVApacA27AKn

pEBHICP27

Opti-MEMl (Invitrogen)

PBS缓冲液

蔗糖

膜 酶（0.25% ) ， EDTA (〇 _02%) (Invitrogen)

仪器

一次性注射器（20 ml)

血细胞计数板

孵 育 箱（保湿， 37°C ， 5 % CO2)

带探头的超声波破碎仅（如 Sonifer 250; Branson)

注射器针头过滤器（〇.45 mm, 聚醚砜膜； Sarstedt)

组织培养瓶（75 cm2)

组织培养板（直 径 60 mm)

超速离心机（ Sorvall SS——34 转头）

超纯离心管（30 ml, 25 mmX89 mm; Beckman)

方法

共转染包装缺陷型的HSV-I 辅助病毒DNA与载体DNA

1.准备待转染的V E R 02-2细胞

a. 用含有500ptg/ml G418及 含 10% FBS的 DMEM培养基培养VER02-2细胞每周传代两次，用 75c m 2 组织培养瓶将细胞按1 : 5 的比例放置于15m ! 新鲜养基中传代。

b. 在转染的前一天，移去培养基，用 P B S 冲洗细胞两次。

c•加人3m l 的胰酶/E D T A 。将培养瓶于37°C 孵 育 l O min，使细胞脱壁。

d•用血细胞计数板进行细胞计数。每个直径60m m 的培养板接种I.2 X I O ⁶个细胞于 3m l 含 10% F B S 的 D M E M 培养基中。

2•为每个直径60m m 的培养板准备两个加有2504 O p t i - M E M I 的 15m l 锥形管。

a•向其中一个锥形管中加人0 •5ug 的 P H S V /A A V 、 2 ug 的 f H S V A p a c A 27A K n 和〇.2ug 的 p E B H I C P 27。混勾并在室温下醉育5m i n 。

也可以增殖型的、包装缺陷型的H S V -I黏粒D N A 作 H S V -I辅助病毒DNA (Fraefel1997)。

b•另一管中加人16fxl 的 Lipofectamine。混勻并在室温下赙育5m i n 。

3•将上述两管混合。混匀后室温下放置30m i n 。

4 . 向含有D N A - L i p o f e c t a m i n e 转 染 混 合 物 的 管 里 加 人 〇 . 9 m l的 O p ti-M E M I 。

5.用2m l 的 O pti-M EM I 冲洗 V E R 0 2 - 2 细胞培养物（见步骤i) 一次。细胞在转染的时候应该处于汇合状态。

6•将细胞培养液吸出，加入转染混合物。于 37℃ ， 5% c 〇2的孵育箱中孵育化。

7 . 吸出转染混合物，用 2m l 的 O p t i - M E M I 清洗细胞3 次。
8•加人3.5m l的含有6 % FBS的DMEM培养基。在 37°C 5% CO2 的孵育箱中孵育2〜3d。

收获包装的载体

9•用橡胶细胞刮刀将细胞刮下。

10.将悬液转移到15m l 的锥形管中。将锥形管放置于加有冰水的冰槽中。

11.将超声波破碎仪的探头置于细胞悬液液面下约〇.5c m 。用 20% 的 输 出 功 率（55W )

超声破碎20m i n

12.4°C , M O O g 离 心 l〇 m in ，除去细胞碎片。

1 3 . 用连在2 0 m l—次性注射器上的〇.45um 注射器针头过滤器，将上一步得到的上清液过滤到新的1 5 m l锥形管中。

14.取出一份样品用于测定滴度 （步 骤 19)，其余的分装为每份im l 的若干份。

1 5 . 将分装的样品置『 于干冰/乙醇中。于一 8 0 °C保存。

也可以在冻存之前先将样品浓缩（步骤见下）。载体可在一80℃下至少保存6 个月而不影响滴度。

16.按下面的步骤浓缩样品。

a. 将步骤14所得载体溶液转移到含有2 5 % 蔗糖的H B S S 的 3 0 m l 离心管中。

b•用 S 〇 rvaIlSS>34 转头， 16°C ， 20 000r/min 离心 2 h 。

c. 将所得沉淀重悬于约 3 0 0 ul 的 H B S S 中。

d•取出一部分样品测定滴度（步 骤 19)，将其余的分装为每份 30fXl 的若干份。

e. 于干冰/乙醇中冰冻， 一 80°C 保存。

扩增子储存液的滴定

为了检测扩增子储存液中感染性质粒的浓度，用这些扩增子去感染细胞。 24〜48 h后 ，计数表达转基因的细胞以计算滴度，用每毫升中含有的转导单位表示。

17.将 V E R 0 7 6 细胞以每孔 I X l O ⁵ 个细胞的浓度，接 种 到 2 4 孔板中，每孔中加有0.5m l 含 1 0 % F B S 的 D M E M 培养基。在 37°C ， 5 % C O 2 的孵育箱中孵育过夜。

1 8 . 吸出培养液，用 P B S 清洗每孔。

19.分别将 0 •lul、 1ul、 5ul的质粒储存液稀释到 250ul 含 2 % F B S 的 D M E M 培养基中，然后加到细胞中。

20.在 37°C ， 5 % C O 2 的孵育箱中孵育 1〜2d 。

21.用合适的方法检测转基因的表达量 （如绿色荧光蛋白、免疫细胞化学染色、 X-gal染色）。

22.计数表达呈阳性的细胞，用转基因表达阳性的细胞数乘上稀释的倍数以计算载体的滴 度 （T U /m l )。

在感染 HSV/A A V 杂合载体的人类细胞中，鉴定载体序列和 A A V S l 序列之间特定性位点