营救、扩增、大规模生产辅助病毒依赖性载体

营救、扩增、大规模生产辅助病毒依赖性载体

材料

CaCl2 (2. 5m o l /L )

用 0.2um 滤膜过滤除菌，用密封锥形管分装， 4°C 保 存 。

氯 化铯梯度溶液（1.25 g / m l 和 1.35 g/m l )

对 于 I. 25 g/m l 和 I. 35 g/m l溶 液 ，分 别 将 54. Og和 70. 4 g 的 固 体 C sC l加 人 到 146. Oml和129.6m l透析缓冲液中，再 用 0.2/xm过滤器过滤。取 其 中 1.00m l用于检测浓度。

2 X 柠檬盐

270m m o l / L K C l

30m m o l / L 柠檬酸钠

用高压灭菌锅在 121°C 灭 菌 45 min。

透 析 缓 冲 液（l 〇 m m o l /L T r i s -H C l ， p H 8.0)

用高压灭菌锅在 121°C 灭 菌 45 min。

D N A 酶 I

准 备 IO m l 含 有 20 mmol/L T ris-H C l和 IOOmg 牛 的 胰 腺 D N A 酶 的 溶 液（PH7. 4 ) 、50m m ol/LNaCl、 l i r n n o l / L m T < ! > 、 O .lm g/m l 牛 血 清 白 蛋 白 、 50% (V V V ) 甘 油 ，保 存 在 -2 0 °C 。

乙 醇（7 0 % 和 9 5 % , V /V )

溴乙啡啶

胎 牛 血 清（F B S ) , 热失活

L -谷氨酰胺

甘油

121°C 高压灭菌45 min 除菌。

HDA28E4LacZ

该 H D A d载体包含一个mCMV-fccZ表达盒

H E P E S 缓冲盐水（H B S )

21m m o l / L H E P E S

137m m o l / L N a C l

5m m o l / L K C l

0•7m m o l / L N a 2 H P O 4

5.5m m o l /L 葡 萄 糖

用 N a O H 调 节 p H 至 7. I , 再 用 0.2-um 的滤器过滤除菌。滤 液 4° C 储存于紧密封严的塑料管中。 HBS 溶 液 的 pH 对转染效率极为重要。

潮霉素

氯 化 镁（2m o l /L )

121°C 高 压 灭 菌 45 min。

最 低 必 需 培 养 基（M E M ; Invitrogen 61100)

P B S + + (磷 酸 缓 冲 盐 水）

在 P B S 中 加 人 0. O l 体 积 68m m ol/L 的灭菌的 MgCl2 和 0. 〇 1 体 积 的 CaCl2。

青霉素 / 链霉素

p H D A d

链霉蛋白酶溶液

用 1 0 mm〇 1/L Tris-HCl (pH7. 5 ) 溶液制备 20m g/m l 链霉蛋白酶溶液。该溶液于 56°C 保温
1 5 m in , 再 于 37°C 保 温 I h , 并储存在一 20°C。

链霉蛋白酶-SDS 溶液

用含 0. 5% 的 S D S ， 10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4 ) 及 10 mmol/L EDTA (pH8. 0) 的溶液配置〇.5 m g /m l 的链霉蛋白酶溶液

R N a se A C 10m g/m l)

鲑鱼精 DNA (2ug/ul，溶 于 T E 缓冲液）

脱氧胆酸钠(5% W /V )

用 0. 2uL 的 滤 器 过 滤 除 菌 。

蔗 糖 溶 液（4 0 % W/V)

用 0_ 2^m 的 滤 器 过 滤 除 菌

TE
1 0 m m o l/L T ris -H C l ( p H 8. 0)

lm m o l/L E D T A ( p H 8. 0 )

121°C高 压 灭 菌 45m in除 菌 。

T ris -H C l (1 0 0 m m o l/L ， p H 8. 0)

病毒裂解缓冲液

在 T E 缓 冲 液 中 加 人 S D S 至 终 浓 度 为 0 . 1 % (W /V ) 。

仪器

贝克曼 S W 40 T i 转头和超净离心管（342413) 、

贝克曼 S W 3 5 转头和超净离心管（344057)

培养 皿（60 m m 和 150 m m )

电磁搅拌（Bellco Glass 7785-D 200)

Slide——A-Lyzer 透 析 卡（Pierce 66381)

Southern 印记杂交材料和试剂

光谱计和样品池

转 动 烧 瓶（Bellco Glass 公司）： 250m l (1965-61002) 和 3L (1965-61030)

方 法

单层培养 1 1 6 细胞系

116 细胞培养在 150 mm 的培养皿中，加 人 M E N 和 10% 热灭活的 F B S 、 0• l m g / m l潮霉素、 l O O U /m l 青霉素/链霉素 和 2m m o l /L L -谷酰胺。当细胞达到 90% 汇合度时,将细胞分成两份（每 2 天）或 者 三 份（每 3 天) 。 记得在使用前将培养基加热到 37°C。

1.去除培养基。

2.轻敲培养皿的一边来分离细胞。

3.取适量容积的新鲜培养基，将细胞悬浮在其中，并将温度控制在 37°C ，放于新的培养基中。

一般情况下，在分离细胞 2d 后 ，转 染 116 细胞以保证充分接触细胞。一 个 铺 满 15 〇 m m 培养 皿 的 116 细胞能够分成 2 0 个 6 0mm 培 养 皿 来 培 养 。

制备 HDAd

首先构建 p H D A d 。 我们使用传统的分子生物学方法，将感兴趣的表达盒插人到P A 28E 4 。 为了能够有效地包装， H D A d 的基 因 组 需 要 为 3 7 . 8 〜 27. 7k b (B ettetal.1993; Parks and G r a h a m 1 9 9 7 ) 。 在 H D A d 基因组的其他地方不目旨含有用于将H D A d 从质粒上切割 下 来 的限制性内切核酸酶的位点。 关 于 H D A d 设计的其他方 面 ，请参考前言部分。高质量的 DNA 质粒对于载体的高效制备很关键，因此我们使用 CsCl超速离心来纯化质粒（NgetaL 2002b ) 。 下面的步骤是关于制备和扩增 H D A d 的。 如果要扩大规模，需要增加相应的载体。

4•将 116 细胞分到 60m m 培 养 皿（每个培养皿一个载体）中， 2d 达 到 7 0 % 汇合时转染。在转染前 lh ，去除培养基，加 人 5 ml 新 的 MEM 和 1 0 % FBS。

5•在 25〜50M 1 体积里面，使用适当的限制性内切酶消化 lOugpHDAd。

6.在 65°C ，培育 20m i n 。

a•立即使用消化好的 D N A 或者保存在 4°C ，第二天使用。

b. 用琼脂糖凝胶电泳检验 0. 5M 1 消化后的 D N A ，同时用溴化二氨乙苯啡啶染色。完全的消化应该只产生两条带： H D A d 基因组和病毒质粒序列。

7.通过聚苯乙烯管将 5 网鲑鱼卵 D N A 加 到 0. 5m l H B S 缓冲液中。用最大的速度搅拌 l m i n 。

8 . 加入消化好的 pHDAd，小心地完全混合。

9•逐滴加人 25fJ 2. 5m o l / L 的 Ca C l 2 ， 边加边混合。
这时溶液变浑浊但没有块状物质出现。

10.在室温下孵育 30 min。

1 1•将 0•5m l 的 p H D A d 溶液一滴滴加入到 1 1 6 单层细胞中，但不要去除培养基。

12•摇动培养皿，使沉淀物均匀分布，孵育过夜。

13.第二天，去除培养基。

14.用含有 1 0 % FBS 的 Im l 的 MEM 洗两次。

15.立即用 AdNG163 转染细胞，同时加人 5pfu/个细胞和 PBS, 使体积达到 0. lm l。

16•培育 lh ，每 隔 IOmin 摇动一下培养皿。

17.加入 2. 5 ml MEM 和 5 % 的 FBS。

18.48 h 后，检测细胞的所有病理效应（CPE)。 9 0 % 的细胞应该变成圆的，脱离培养皿。如果不是这样，看这一章末的问题解决方法。

I9•将细胞刮到培养基中，再放到一个小瓶子里面。加 人 0.1 体积的 4 0 % 鹿糖溶液，储存在一 80°C 。 取出 0.5m l 的细胞悬浮液来提取 DNA，检测载体扩增情况（参照步骤 26)。

HDAd 扩增

20•在 37°C 解冻细胞悬浮液，在 37°C 下达到平衡。混合溶解。

21.在多种转染浓度 2P fu/个细胞和 0 •4m l 转染细胞悬浮液中，辅助病毒和 H D A d 共同转 染 9 0 % 的 60m m 培养皿 116 细胞系溶液。

22.在保温箱中反应 I h , 每 隔 I O m i n 摇动一次。

23.在转染 I h 后 ，加入包含 5 % F B S 的 2. 5m l M E M 到单层细胞中。

24.重复步骤 18〜2 3 , 直 到 H D A d 滴度达到最大。循环次数可能会变化。

HDAd 扩增检测 .

我 们 一 般 并 行 扩 增 能 够 容 纳 表 达 盒 的 H D A d (如 H D A 2 8 E 4 L a c Z ; 图 3 B ) ，因为此载体的滴度在 2 9 3 细胞系中能够非常容易快速地通过 X -g a l 染 色 来 检 测（N g et
al.2002a) 。 在每个过程中，对 照 H D A d 的滴度会上升 1 0 〜 1 〇〇 倍 ，一 直 到产生最大滴度 ，且被检测到这一过程像预期的那样（图 3C )。对 于 大 部 分 没 有 报 道 基 因 的 载体的扩增检测，是通过提取每一步中共转染的细胞总 D N A ， 用琼脂糖凝胶电泳、溴 化
二氨乙苯啡啶染色来检测的（图 3D ) 。

25.在 2 9 3 细胞系的滴度上，用 X -g a l 染 色 测 定 含 有 的 载 体 的 滴 度（N g et al,2002a)。
在每个过程中，对 照 HDAd 的滴度会上升 10〜100 倍 ，一直到产生最大滴度，且被检测到的这一过程像预期的那样（图 3 0 。

26.得到感兴趣的 H D A d 载体扩增。

a. 在小离心机中离心细胞悬浮液（在步骤 1 9 中得到的）， 750 g 离 心 l m i n ，去掉上清液。

b •重新在链霉蛋白酶-S D S 溶液中悬浮细胞颗粒， 37°C 下过夜培育。

c•加入 0 .5 m l 的 9 5 % 乙醇。让管子倒立，混合溶液，直到看到沉淀物形成。

d. 用最大速度在小离心机中离心 l m i n ，使 D N A 形成小球。

e. 用乙醇清洗 D N A 两次， 干 燥 。

f. 在适当容积 T E 下重新悬浮 D N A 。

g •在 65°C 下加人 D N A ，搅动，直到溶解。

h . 消化样量，用适当的限制酶酶切。

i•用琼脂糖凝胶电泳和溴化二氨乙苯啡啶染色来检测。

如 果 HV-和 HDAd-特异条带能够明显的区分，说 明 HDAd 的 滴 度 达 到 最 大（图 3D)。注意 ， HV-specific 带是我们希望看到的，而不是污染，因 为 H V 基因组不包含包装信号；可以通过 Southern 印 迹 来 检 测（图 3D)。如果在几个步骤里面都看到这种现象，就取第一个出现这种现象的结果，因为载体或者辅助病毒的重排的概率随着步骤的增多会升高。如果得不到上述结果，就不断重复。

27.在多种转染浓度 2pfu/个细胞和含有最大 H D A d 滴度的 0. 5m l 菌液中，辅助病毒和H D A d 共同转染 9 0 % 的 60m m 培养皿 116 细胞系溶液。 .

2 8 . 在转染 4 8 h 后 ，检测细胞，看是否有完全的各种细胞病理效应，将细胞刮到培养基中。

29.750 g 离心细胞悬浮液 5m i n 。去除上清液。

30.重新将细胞团悬浮于 I m l 100m m o l / L Tris- H C l (p H 8 , 0 ) 溶 液 和 1 0 % 甘油，冰冻在一 80°C 。

大规模生产 HDAd

辅助病毒和高滴度的 H D A d 共转染 116 细胞，在悬浮液中共生长。

31.按照下述方法准备 116 细胞系：

a. 将含有 116 细胞的废培养基从 8 个汇合培养皿中转到一个 3L 的细瓶子里。

b. 敲打培养皿，将 116 细胞分开。将细胞和剩余培养液分到 3L 细瓶子里面。

c. 在 37°C 下 ，加人 M E M 和 5 % 热灭活的 F B S 、 0 •l m g /m l 潮霉素、 l O O U /m l 青霉素/链霉素和 2m m o l /L L -谷氨酸，使最终容积为 1L 。拧紧所有的盖子。

d•在 37°C 下 ， 60r/m i n 磁性搅拌机上过夜培育。

在细瓶子里，细胞生长不需要潮湿，充 满 C O 2 的环境。

e. 第二天加人 0. 5L , 继续过夜培育。

f. 第二天加人 0.5L ，继续过夜培育。

g. 第二天加入 1L ，继续过夜培育。

最 终容积为 3L 。细胞密度每天增加，这可以通过在加培养基之前数数来确定。

32•按照下述方法数悬浮液中 116 细胞数：
在共转染时，细胞浓度非常关键，因为这将决定加入的辅助病毒的量和 H D A d 的产量。

a. 将 2m l 的细胞加人到 15m l 圆锥形管子里。

b.37°C 下加人 2m l 2 X 梓檬酸盐。在最大设置下混合 10s。

c•在 37°C 下 ，培 养 5〜l O m i n。

d. 在最大设置下混合 10s。

e•使用血球计测量，得到两个独立的细胞数。

如果这两个细胞数相差很大，则重新测量。而且要保证没有大量的不能计数的细胞团。细胞密度应该为 2 X 10⁵〜4 X 10⁵个/ml。

f•在 3L 培养基中取 0 •I m l 细胞悬浮液到 24 孔培养皿的一个孔中，加 人 I m l 新鲜培养基。

这些样品作为没有转染的细胞健康状态的对照。这些样品在几个小时后，将回贴，重新形成单层细胞。

33.大规模共转染 116 细胞系：
a•在室温下， 750 紅离心 5m i n , 从 3L 培养基中收集细胞。保 存 〇.5L 废培养基。

b•用 I O O m l 废培养基重新悬浮细胞团，转 到 250m l 细瓶子里面。

c. 在转染量为 2pfu/m l 和 H D A d 溶 解 时（步骤 3 0 ) 加人辅助病毒共转染细胞。在37°C 下，用 60r/min 培养 2 h 。

d•将共转染的细胞转移到 3L 的细长小瓶子里。加 人 0. 5L 的废液和 I.5L 的新鲜
M E M 及 5% 的 F B S (总共 2L )。
e•将 0 • I m l 的共转染细胞转到 2 4 孔板培养皿中的一个孔里面，加 人 I m l 新鲜M E M 和 5 % F B S 。

这些细胞重新贴壁，但 是 48 h 后变圆，离壁。如果不是，参考后面的问题解决方法

f. 在 37°C 下 ，用 6 〇 r/ m i n 培养 2 h 。

g. 室温下，用 750 g 离心 5m i n ，收集共转染细胞。

h . 重新将细胞悬浮在 15m l 的 l O O m m o l / L Tris-HCl (p H 8. 0 ) 溶液, 中。转 到 50m l锥形管子中，和 H D A d —起纯化。

也可以用这种方法：重 新 将 细 胞 悬 浮 在 15m l 的 100 mmol/L Tris-HCl ( p H 8 . 0 ) 溶 液 中 ，加 人 10% 甘 油 ，储存在一 80X：下 ，以备后用。

HDAd 纯化

34.加 2. O m l 5% 的脱氧胆酸钠溶液到共转染细胞溶液。混合液立即变浓，变成凝胶状。

35.在室温下，搅拌培养 30m i n 。

鉴定。

50•等分部分载体并储存在一 80°C 。
按 照 3 3 步叙述的步骤，而 不 是 在 33c 步 中 叙 述 的 从 150_的 板 中 用 200vp/个细胞代替溶菌产物。使用纯化的 HD Ad 代替粗溶菌产物可以极大地简化生产. 改善黏稠性。

HDAd 检测

方法

方法

物理滴度

1.为评估载体的物理滴度要做的前期准备有：物理滴度是指病毒颗粒在制备的载体中的浓度，它根据病毒颗粒溶解后在 260m n 出的吸收峰来测量（Maizel et al.1968)，再据载体基因组大小矫正（Ng etal.2002a)。这个方法的最终目的是检测病毒 DNA在载体中的多少，并 用 vp/m l 表示。

a. 将病毒颗粒缓冲液加人到纯化载体样品中（步骤 49)，使容积达到 0.5 ml。

同 时 做 一 个 空 白 对 照 ，即 把 病 毒 颗 粒 缓 冲 液 加 到 载 体 赋 形 剂 [10m m ol/L Tris-HCl( P H 8 .0 ) 和 10% 的甘油] 中 ，使容积也达到 0.5m l。

b. 简单地混合两种样品，注意不要冒泡。

c•在 56°C 培育样品 10mol/L。

d•再混合样品 lmol/L。

e. 使用空白对照作为 260n m 和 280n m 处的参考数据。接着检测载体样品在 260n m和 280n m 处的吸收峰。

260/280 的比值，是相对纯度，应该在 1.3 左右。

f.利用下面的公式计算在 260n m 处的吸收峰 vp/ml:
vp/ml== (260nm 处的吸收峰）（稀释系数）（I .IX lO 12) (36V (载体大小，单位 kb)

辅助病毒污染

HDAd 总是被辅助病毒污染，而且精确地测量污染水平很关键。

2•用 Southern 杂交方法分析辅助病毒污染（图 4B)。

也可以用实时定量 P C R 分 析（Palmer and N g 2003), 但 是 用 菌 斑 分 析 很 不 稳 定（Palmerand N g 2005)

H D A d 基因组结构

3•检测载体基因组结构。

a•提取 DNA, 将一个纯化的载体样品用适当的限制酶消化。

b•用琼脂糖凝胶电泳和溴化二氨乙苯啡啶染色来确定 H D A d 的基因组结构。S o u t h e r n 杂交的方法更灵敏（图 4B , 图 4 0 。