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    基本方案1 单倍体细胞具体基因位点的分析

    相关实验：单细胞 DNA 和 FISH 分析应用于植入前基因诊断实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    0.5ml 管中的单细胞或（卵）裂球 用石蜡油覆盖使其溶化并中和
    10 X 游离钾扩增缓冲液 4dNTP 混合液 正反引物 Taq DNA 聚合酶 MgCl2 扩增缓冲液 轻石蜡油 次级 PCR 正反内外引物 10 X TBE 缓冲液 DNA 凝胶上样缓冲液 溴化二氨乙啡唆液 10 X One-Phor-All 缓冲液 Plus
    澄清聚丙烯 PCR 反应管 热循环 PAGE 高分辨制作和电泳仪

    步骤

    L 如果适当，按照P E P (单元1 . 3 ) 溶解中和单细 胞 或 卵 裂 球 （ 支 持 方 案 1： )。 当 在 D M D 基 因 内 使 用 不 同 的 外 显 子 比 较 分 析 检 测 到 缺 失 时 ， 准 备 用 消 化 P C R 产 物 是 很 有 必 要 的 。 Z F X 和 ZirY 基 因 与 相 关 的 D M D 外 显 子 P C R 产 物 的 P C R 产 物 相 等 。 因 此 ，当 符 合 D M D 基 因 的 步 骤 排 除 后 ， 第 2〜 7 步 和 第 8d 步 必 须 伏 用 Z F X 和 Z F Y 基 因 的 材 料 和 条 件 。 在未执行PEP 的地方执行的主要PCR (直接单位点PCR) 2a. 准备以下1〇次反应的标准混合液以保证分析每1〇个细胞或卵裂球： 50W IOX游离钾扩增缓冲液（ I X 终浓度） ； 5pl 25mmol/L 4dNTP 混 合 物 （〇 • 25mmol/L each dNTP 终浓度） ； 6. 25〜20yl20jumol/L 正 向 引 物 （〇.25〜0. 8p 〇 nol/L 终浓度；表 9. 9. I ); 6. 25〜20/J 20|uanol/L 反 向 引 物 （ 0.25〜0.Sjumol/L 终浓度；表 9. 9.1 ); 2pl 5U/jul D N A 聚 合 酶 （1U 每次反应 final); 加 H 2O 至 450jul。 3b. 加 45^1标准混合液B 到每个现备的〇.5ml P C R 反应 管5 4 部分单细胞/卵裂球 反应产物中，加 50jul石蜡油覆在反应液上面。 4 . 每个位点做初级PCR 使用热循环的条件参见表9. 9. 3。5.准备10次反应的标准混合液以备9 次足够的次级P C R : 50W 10X P C R 扩增缓冲液包含15mmol/L MgCl2G X 终浓度） ； 5jul 25mmol/L 4dNTP 混合液(0. 25mmol/L 每个 dNTP 终浓度） ； 5〜2( V 20Mmol/L 正向内部引物(0. 2〜0. Spmol/L 终浓度;表9. 9. 2); 5〜2(V 20)umol/L 反向内部引物(0. 2〜0. 8fxmol/L 终浓度;表9. 9. 2); 2“ 5U / V 1T 叫 D N A 聚合酶(1U /每次反应终浓度） ； 加水至480 pi。 可选择联合P C R 引物中相对核心的一种引物(如半嵌合P C R )。
    通 过 异 源 双 链 核 酸 分 子 形 成 去 解 释CFTRAF508或 H EXA 的外显子 11+TATC 突变 8a.从对照样本与扩增的待检样品中取5jLj 与以前扩增的已知或杂合样本或C F T R A F 508或 的 外 显 子 1 1 + T A T C 突变的样本等体积混合(推荐用两个正常样 本和一个突变)。 9a.在 93°C 下加热混好的样本lOmin，使所有的D N A 链变性，然后冷却到65°C 保持 lOmin，使单链复性。 IOa. 用微型蛋白II微 型 P A G E 胶模型仪器，在 I X T B E 缓冲液中准备8 % 〜 10% 的非变 性聚丙烯酰胺(单元7. 2)。 Ila•加入IjUl D N A I O X 的上样缓冲液到每个样品中然后点到微胶上，其中一个泳道上 包括 D N A marker。 12a. 在 200V 下电泳样品30min，用 0. 溴化乙锭染色l〇 m in 。分析胶检测出来突 变 ，这些与正常样本分别相差3b p 和 4bp。 通 过 直 接 数 据 录 入 解 释 H E X A 的 外 显 子 / 内 含 子 1 2 的点突变 8b.加 人 I 消化缓冲液到I V 扩增好的检测样品和对照样品中，然后加入 20〜 2 5 U D 办 I ，在 37°C孵化 90min。 9 b . 用微型蛋白IIP A G E 微型胶模型仪器，在 I X T B E 缓冲液中准备1 0 % 的非变性聚丙 烯酰胺(单元7. IOb.加入 2jul D N A I O X 的上样缓冲液到每个样品中然后点到微胶上，其中一个泳道上 包括 D N A marker。 lib. 在 200V 下电泳样品30min，用 O.ljug/m l 溴化乙锭染色lOmin。分析胶中检测的突 变，突变体的消化产物另外有个85b p 的片段
    以 B c Z 工 消 化 去 检 测 F V n i 基 因 的 内 含 子 1 8 中 的 限 制 性 位 点 多 态 性 。 8c.加 入 3 0 U BcZ I 到每个扩增好的检测样品和对照样品中，直 接 在 ⑷ ^的 油 中 孵 化 60min。 9c. 用微型蛋白n P A G E 微型胶模型仪器，在 I X T B E 缓冲液中准备8 % 的非变性聚丙婦 酰胺(单元7. 2)。 IOc. 取1〇4已消化的产物与IjuI I O X 上样缓冲液相混，然后点到微胶上，其中一个泳道 上包括 D N A marker。 11c. 在 200V 下电泳样品30min，用 0. ljug/ml溴化乙锭染色10min。分析胶检测到的突 变，突变体的酶切产物另外有339bp、222bp、ll7b p 片段的带（ 当为杂合子时） ，或仅 仅 有 339b p 片段的带(当为纯合子时)。 通 过 H a e 瓜 酶 切 辨 认 Z P X 和 Z F Y 基因 8 d . 加 人 5jul扩增好的检测样品和对照样品到5^1 2 X One-Phor-All缓 冲液中，其中包括 5 U ，在 37°C解化 90min。 9d. 用微型蛋白IIPAGE 微型胶模型仪器，在 I X T B E 缓冲液中准备5 % 〜8 % 的非变性 聚丙烯酰胺(单元7. 2)。 IOd•加入1^1 D N A I O X 的上样缓冲液到每个酶切的样品中然后点到微胶上，其中一个 泳道上包括D N A marker。 Ild•在200V 下电泳样品30min，用 0 •lpg/m l 溴化乙键染色lOmin。分析胶中检测到的 突变:女性细胞产物片段为3 0 0 b p和 44bp ，男性细胞产物片段为300bp、216bp、84bp 和 44bp。 通 过 比 较 分 析 不 同 的 外 显 子 去 检 测 D M D 基 因 的 缺 失 8e .在 0. 5 % T B E 中准备1. 5 % 〜3 % 琼脂糖胶。 9e . 加 入 I - D N A I O X 的上样缓冲液到每个扩增的样品或对照样品中然后点到琼脂糖 胶上。 IOe.点 HaeDI酶 切 的 Z F X 和 Z F Y 产物到同一个胶上，其 中 一 个 泳 道 上 包 括 D N A marker 〇 lie. 在 10V /c m 下电泳样品20〜30min，用 O.ljug/m l 溴化乙锭染色20min。分析胶中检 测到的突变(在表9. 9. 2 中看片段大小） 。 支持方案1 引物延伸预扩增法(prim er-extension p ream p lificatio n ，P E P )扩增单个二倍体细胞全基因组 具体设置见单元1. 3 支持方案2 。 注意配制溶液和所有步骤中均使用H P L C 级别的 水(如Fisher，见附录） 。另外，在步骤1 准 备 10个反应所需P E D 溶液，而不是100个;步 骤 2 中在0 . 5 m l的管子中放人单个二倍体细胞或卵裂球，而不是精子;步骤4:在运行 P E P 扩增循环时改用下述参数t 起始步骤： 5min 95〇C 变性
    支持方案2 植入前胚胎活检 注意:接触细胞的溶液和仪器设备必须经过适当的方法进行灭菌或消毒;培养基和溶 液须用0. 2 2 _ 的 MiUex-G V (Millip0re公司） 滤膜过滤;轻矿物油须用0. 45_的 滤 膜 (Nalgene公司)过滤;过滤时最初的小部分应予以丢弃;玻璃毛细管在120° C 高温干燥灭 菌 3h ;对于微量吸管和P C R 管须用紫外交联仪最大能量照射15min。 注意:在配制与胚胎接触的试剂和培养基时使用Milli-Q 纯净水(符合美国病理学院 试剂用水I 类标准） ， 或胚胎测试过的超纯水。 注意:移液管须在实验前预先准备好。 材料(标V 的条目参见附录1) V T y r o d e s酸溶液 V 胚胎培养液和洗涤液(方法见胚胎培养和显微操作相关培养基配制） 培养级轻矿物油( E M science公司)过滤除菌，并用培养基洗涤和平衡 V 活检用培养基(方法见胚胎培养和显微操作相关培养基配制） V 卵裂球洗涤液(方法见胚胎培养和显微操作相关培养基配制） 细胞裂解液:200mmol/L K O H /50mmol/L D T T (新鲜配制） 人胚胎 P C R 用轻矿物油(Perkin-Elmer 公司） 或 CMl-Out 14 石蜡油（M J Research) V 中性缓冲液 显微拉针仪（Sutter Instruments P-97 . 或 Narishige P B-7) 显微锻针仪（Narishige M F -9 或 Research Instruments M F 42) 毛细玻璃管（Vitrocome 公司 Pyrex 管:外径 0. 87m m ，内径 0. 7m m ;或 Sutter Instrumerits硼硅酸管:外径I.O m m ，内径0. 75m m )，120°C 高温干燥灭菌3h 紫外交联仪 组织培养皿(Falcon):60m m X 15m m 、50m m X 9m m 、35m m X IOmm 37°C 、5 % C O 2 培养箱(如 Forma) 37°C 热板 0. 5m l 清洁级聚丙婦P C R 管(Out Patient Services)紫外交联仪最大能量照射15min Olympus 1X 70倒置显微镜，配 置 Hoffman系统（4O m m W D )、各类物镜（H M C EF 10X 、H M C 20X L W D )、可水平调节载物台和Brook stage warmer(另可选择 配置相机、监视屏、录像机等） 钻石笔(玻璃刀也可） 抗震台（ Newport)
    双 持 针 器 (Narishige) 胚胎打孔和活检微管控制系统包括： 微 驱 动 装 置 气 密 注 射 器 (Hamilton) support base(base、微 驱 动 装 置 和 气 密 注 射 器 可 由 Stoeking公 司 事 先 安 装 好 ） 连 接 器 聚丙烯管(Intramdic公 司 PE90) 胚胎吸持固定微管控制系统包括： 螺 旋 推 栓 气 密 注 射 器 (Hamilton) 连 接 器 聚丙婦管(Intramdic公 司 PE90) 标准钳 两个直立显微操纵杆(Narishige;电动粗调和液压微调） 两个带光电源的体视镜，宽视场的更好 橡皮泥(可选） 嘴吸式的显微操纵系统(Fisher)须经过一个0. 2 2 p m 的 Millex-GV(MiUipore公司） 滤膜连接到一个长6 0 c m 的聚乙烯管后，再连接到显微持针器及持卵针上（Lei_ ca)或毛细管持卵管上(Microcap，Drummond) 层流罩 热板 1. 显微吸管(针)制备:用显微拉针仪、煅针仪和毛细管制备下述各针，并用紫外交联仪最 大能量照射15min灭菌(适合0. 7 m m X 0 . 8 7 m m 毛细管，如 是 0. 7 5 m m X l . O m m 毛细 管则可轻微上调） ： 持卵针:65〜80/^m 外径(大一点也可） ，25〜30p m 内径，加热磨光并使末端变钝； 打孔针:5〜IOjum外径； 活检针:40〜SOjam外径(适合于8 细胞以下胚胎） ，3〇〜40； x m 外径(适合于8 细胞以上 胚胎） ，加热磨光并使末端变钝； 细胞转移管:50〜eOjum外径。 为使 在 显 微 操 作 是 高 效 地 持 卵 、打 孔 和 活 检 ，各 显 微 针 最 好 准 备 一 系 列 的 尺 寸 型 号 ，一 套 显 微 针 可 在 同 一 个 病 例 中 重 复 使 用 ，但 是 注 意 不 要 出 现 破 损 、细 胞 碎 片 附 着 ， 并 保 持 其 工 作 的 高 效 性 。 2 . 制 作 胚 胎 转 移 装 置 :可 用 拉 细 的 巴 氏 德 管 ( 端 头 内 径 1 2 〇 m m ) ，也 可 用 机 械 吸 胚 中 的 毛 细 管 代 替 (如 I V F 实 验 室 中 用 于 卵 子 去 颗 粒 细 胞 和 转 移 胚 胎 的 毛 细 管 ） 。 3 . 将冻存的Tyrodes酸解冻后室温放置。 4 . 为 每 个 胚 胎 准 备 下 述 材 料 。 a. 活检培养皿1 个(用于活检胚胎的培养） ：在一个6〇 mm><15mm组织培养皿中用培 养基配制微滴，约 20W ，上面覆盖用培养基洗涤和平衡后的石蜡油，并将微滴培养 皿置于37°C 、5 % CO2、饱和湿度的培养箱中平衡Ih后待用。 b . 活检皿1 个:在一个盖子倒置5 0 m m X 9 m m 的组织培养皿中央用活检培养基配制
    一个2〇4的微滴，用一次性的吸管将滴稍铺开，再用足够的石蜡油(3ml)覆盖微滴; 将组织培养皿置于层流罩或无菌环境(如放在一个更大的150m m 的组织培养皿内） 的 37°C 热板上待用。 c. 培养皿1 个(用于胚胎活检后培养） ：在—个 6 0 m m X 1 5 m m 组织培养皿中用培养基 配制微滴，约2〇4,上面覆盖用培养基洗涤和平衡后的石蜡油，并将微滴培养皿置 于 37°C、5 % C 0 2、饱和湿度的培养箱中平衡I h 后待用。 d. 胚胎洗涤皿1 个(用于胚胎洗漆） ：在一个35m m X I O m m 组织培养皿加人约2m l 培 养基，置于37° C 、5 % C 〇2、饱和湿度的培养箱中预温和气体平衡I h 后待用（ 也可在 a 步骤的皿中增加至4 个微滴，其 中 3 个微滴用于胚胎洗涤，1 个用于培养） 。 e. 卵裂球洗涤皿(用于卵裂球洗涤） ：在一个3 5 m m X I O m m 组织培养皿加入约2 m l 卵 裂球冲洗液培养基，置于室温下、体视镜旁。 f.P C R 反应管:准备3 个 P C R 反应管(2个用于卵裂球，1 个为空白对照） ，每个管中加 人 5^1细胞裂解液。另外为整个诊断程序准备2 个 P C R 空白管。 5•利用倒置显微镜(配置Hoffman系统)在2 0 0 X 和 4 0 0 X 的放大倍数下对胚胎的发育状 况进行评定和分级。 6.选择适合于活检的胚胎(一般为6〜10个细胞的胚胎） ，将待活检的胚胎分开放置于活 检培养皿中，在皿底和皿盖用钻石笔进行标记编号后放回培养箱。 为方便起见这一步可以省略，而将胚胎直接放入活检皿中（ 第 1 3 步） 。 7•在抗震台上调节好显微操作系统:安装Holder操作臂(右利手的人可将其置于左侧） ， 及在双持针臂上安装好打孔针和活检针(通常置于右侧） 。 8•将持卵针、打孔针和活检针分别通过各自的聚乙烯管连接到显微注射器上。 9•调整好持卵针处于一个小角度状态，并指向倒置显微镜载物台上的照明区域。 10. 调整好显微注射器，通过加压将油推向针的末端，管道内如有气泡，一定要排除，并检 查是否漏油。 11. 运用粗调和微调，降低各针至倒置镜视野范围内，并调整好打孔针和活检针的距离和 聚焦。 12. 将 打 孔 针 浸 人 到 Tyrodes溶 液 中 ，加 负 压 使 针 充 满 Tyrodes溶液至离针尖约 5m m 处。 13. 将倒置显微镜载物台热板预热到37. 5°C (为抵消温度丧失使培养基保持在37. ( T C )。 转移第一个胚胎至预先配制好的胚胎活检皿的微滴中，将活检皿放在热板中央。 14. 在低倍下(100X )对焦找到胚胎，持卵针稍加负压固定胚胎，旋动胚胎寻找比较好的 活检处，并使之处于3 点的位置。 15. 将显微镜转至高倍（ 根据个人需要使用200X 或 400X )，将打孔针接近或靠近透明 带，缓慢加压排出Tyrodes溶液(注意慢，使注射器控制器的压力能有足够的时间传 递到打孔针使Tyrodes溶液排出） 。密切注意，当透明带快溶解穿透时，停止加压，退 出打孔针。注意打孔的大小要确保活检针能进入透明带。将打孔针从微滴中移走。 16. 在低倍下（100X )对焦使活检针靠近胚胎，找到一个可辨别出核的卵裂球，将活检针 穿过透明带开口，并靠近该卵裂球，注意两者之间不要有缝隙，稍加负压，卵裂球会部 分进入活检针，这时，推、扭 、拉、拖使卵裂球与邻近的卵裂球松开黏连，然后将卵裂球
    尽可能全部吸人活检针。 17.将活检针从胚胎中退出，轻加压将活检针中的卵裂球排出，使用机动台将活检卵裂球 移出工作区。 18•如果胚胎处于8 细胞以上阶段，可同时分离两个卵裂球。 19. 持卵针释放胚胎，冲洗各针。将含有胚胎和卵裂球的活检皿转移至体视镜下(用胚胎 转移装置冲洗卵裂球并依次转移到PCR反应管中） 。最好有两台体视镜，并分别调 好放大倍数和对焦，一台用于卵裂球回收，另一台用于洗涤，这样可免于重调体视镜 的设置。 20. 在事先配制好的卵裂球洗涤皿中连续冲洗卵裂球，避免重复冲洗。 21. 打 开 PCR管盖，水平放置在体视镜旁，用橡皮泥或手固定PCR管 ，在体视镜下对焦 PCR管中的上层液面。 22•用嘴吸式的细胞转移装置将单个卵裂球转移到（ 携带尽可能少、体积的溶液)〇. 5mi PCR管中(事先已经加人5M1裂解液） ，即一只手拿住移液管，使管尖进入到PCR管 中，当管尖快接近上层液面时（ 可先不用体视镜而直接观察并引导移液管进人PCR 管） ，在体视镜下观察，使管尖紧靠PCR管壁上并进人裂解液，缓慢加压可看到卵裂 球进入裂解液。转移卵裂球时，要确认每个卵裂球都含有一个核并确实进入裂解液。 立即在把原卵裂球的编号标记在PCR管上。冲洗移液管后才转移下一个活检皿中 的卵裂球。 23. 从卵裂球洗涤皿中吸取少量体积的洗涤液，转 入 PCR管裂解液中作为空白对照。 24. 立即将含有胚胎的活检皿交给胚胎操作人员，将胚胎洗涤3 次后转移至一新的胚胎 培养微滴中和洗涤培养基中。 25. 对其他胚胎重复第1〇〜24步。 26. 当所有卵裂球和空白样品在反应管中准备好后，层流罩下在每个PCR管中加入5〇jul PCR油或液体石蜡，点离数秒，使油或石蜡完全覆盖裂解液。 27. 将 PCR管 在 65°C热盖下孵育15〜30m in，冷却到室温，加 15jlJ 中性缓冲液于反应体 系中(加入到油或液体石蜡面以下） 。 支持方案3 分离有遗传缺陷胚胎的卵裂球用于进一步的检查 注意:该操作必须要得到患者的同意。 注意:接触细胞的溶液和仪器设备必须经过适当的方法进行灭菌或消毒;培养基和溶 液须用0. 2 2 _ 的 M illex-G V(M illip o re 公司） 滤膜过滤;轻矿物油须用〇.45叫 的 滤 膜 (Nalgene公司)过滤;过滤时最初的小部分应予以丢弃;玻璃毛细管在12(rc高温干燥灭 菌 3h ;对于微量吸管和p C R 管须用紫外交联仪最大能量照射15min。 注意:在配制与胚胎接触的试剂和培养基时使用MilH-Q 纯净水(符合美国病理学院 试剂用水I 类标准） ，或胚胎测试过的超纯水。 材料(标V 的条目参见附录1) 置于微滴培养皿(支持方案2)的人类胚胎(有遗传缺陷;基本方案1) VTyrodes 酸
    胚胎培养液和洗涤液(方法见胚胎培养和显微操作相关培养基配制） V 卵裂球洗涤液(方法见胚胎培养和显微操作相关培养基配制） 细胞裂解液:200mmoi/L KOH/50mmol/L DTT(新鲜配制） _PCR 用轻矿物油（ Perkin-Elmer 公司） 或 Chill-Out 石蜡油（MJ Research) 胚胎转移装置(见支持方案2,第 2 步） 两个带光电源的体视镜，宽视场的更好 组织培养皿(Falcon) :3 5 m m X I O m m 细胞转移装置(50〜60/xm外径，支持方案2,第 1步） 嘴吸式的显微操纵系统(Fisher)须经过一个0. 22Mm 的 Millex-G V (MilUpore公司） 滤膜连接到一个长60c m 的聚乙烯管后，再连接到显微持针器及持卵针上（ Leica)或毛细管持卵管上(Microcap，Drummond) 0. 5m l 清洁级聚丙稀P C R 管(O ut Patient Services)紫外交联仪最大能量照射15min 1. 用胚胎转移装置将有遗传缺陷胚胎携带尽可能少的培养基转移至5julTyrodes酸滴中 (在35mmX10mm组织培养皿中） 。 2 . 密切观察胚胎，I m i n 内，可见透明带快溶解时,立即将胚胎转移洗涤皿中。如果透明 带未溶解则将其转移至另一滴Tyrodes酸滴中。 3•用胚胎转移装置将无透明带的胚胎立即转移到5M1卵裂球洗涤液中(在3 5 m m X I O m m 组织培养皿中） 。在卵裂球分散前将胚胎转移至第二滴洗涤液中（ 如胚胎在管径较小 的吸管或细胞转移管中进出时，可造成卵裂球分散)。 4.用嘴吸式的细胞转移装置将单个卵裂球转移到〇.5ml P C R 管中(事先已经加入5jul裂 解液） ，覆盖P C R 油或液体石蜡(支持方案2,第 22〜26步） ，储存在一70°C备用。 支持方案4 分离单个淋巴细胞或类淋巴母细胞 该方法谭述从类淋巴母细胞株中分离单个细胞或分离单个新鲜准备的淋巴细胞，并 用于单细胞D N A 扩增实验模型。 小心:在处理人源性生物材料时一定要小心谨慎。如在吸取可能被E B 病毒或其他 病毒感染的细胞时要小心。 注意:接触细胞的溶液和仪器设备必须经过适当的方法进行灭菌或消毒;培养基和溶 液须用0 •22p m 的 M illex-G V(M iU ipore公司） 滤膜过滤；轻矿物油须用〇.45p m 的滤膜 (Nalgene公司)过滤;过滤时最初的小部分应予以丢 弃 ;玻璃毛细管在12〇°C 高温干燥灭 菌 3h ;对于微量吸管和PCR管须用紫外交联仪最大能量照射15min。 注意:在配制试剂和溶液及所有的实验步骤中要求使用HpLC级别的水(如Fisher)。 材料(标V 的条目参见附录1) 来自男性或女性配子捐赠者的待检的原代淋巴细胞或E B 病毒转染的类淋巴细胞株 RPMI 164〇+HEPES(Sigma)，无血清和蛋白成分 细胞裂解液:200m m ol/L KO H /50m m ol/L D T T (新鲜配制） 橡皮泥(可选） P C R 用轻矿物油(Perkin-Elmer 公司） 或 ChiU-Out 石蜡油(MJ Research)
    中性缓冲液 拉针仪（Sutter Instruments P-97 或 Narishige PB-7) 锻针仪(Narishige M F -9 或 Research Instruments M F 42) 玻璃毛细管(Vitrocome 公司 Pyrex 管:外径 0 •87m m ，内径 0 •7m m ;或 Sutter Instrumerits棚桂酸管:外径I.〇 m m ，内径0. 75m m ;) I E C 临床用离心机或相当的离心机也可 0 • 5m l 清洁级聚丙烯P C R 管(Out Patient Services)紫外交联仪最大能量照射15min 组织培养皿(Falcon):35m m X I O m m 两个带光电源的体视镜，宽视场的更好(黑视场照明也可用） 嘴吸式的显微操纵系统(Fisher)须经过一个0. 22^111的 Millex-G V (M i m Pore公司） 滤膜连接到一个长60c m 的聚乙烯管后，再连接到显微持针器及持卵针上（ Leica)或毛细管持卵管上(Microcap，Drummond) 层流罩 热板 1•使用拉针仪、锻针仪器和玻璃毛细管制作一个25p m 外径的微管，用紫外交联仪最大 能量照射15min灭菌。 2. 洗涤淋巴细胞或和类淋巴母细胞3 次，每次洗涤后室温下1200g 离心5min(I E C 临床 用离心机） ，最后弃上清液，用 HEPES-buffered P R M I 培养基(不含蛋白血清等)重悬 细胞。台盼蓝染色计算细胞活率(附录31)，仅高活率的细胞悬液才能被采用。 3. 无菌条件下，于 0. 5m l 的 P C R 管(薄壁管或用〇.2^1的 P C R 管，但方法需修改） 中加 〇. 细胞裂解液并盖上盖子。 4•在35m m X I O m m 的组织培养皿上滴加3 滴或更多HEPES-buffered P R M I 培养基(不 含蛋白血清等） ，每滴5jul，用细胞洗涤液，同时滴加1 滴 〇.5jul细胞悬液(第2 步准备 的） ，上述各滴间靠近一些。 5 . 打开P C R 管盖，水平放置在体视镜旁，用橡皮泥或手固定P C R 管，在体视镜下对焦 P C R 管中的上层液面。 6•用嘴吸式的细胞转移装置，将微管进人培养基，转移少量细胞至第一滴细胞洗涤液滴， 分离单个细胞并转移至下一个细胞洗涤液滴中，洗涤几次后，将携带尽可能少体积溶 液的单个细胞转移到P C R 管中(第7 步)。或者，在 2m l 细胞悬液中分离细胞，至另一 个含2m l 培养基的培养皿中洗涤细胞，再转移至P C R 管中。 7. 在体视镜旁观察，用一只手抓住携带细胞的微管，引导微管进入到P C R 管中，当管尖 快接近上层液面时，转至体视镜下观察，对焦P C R 管中的上层液面及管壁，使管尖紧 靠 P C R 上管壁并进入裂解液，缓慢加压可看到细胞进入裂解液。 8. 重复第5〜7 步直到很容易地可将细胞吸进微管(一般在微滴中每次吸5〜1〇个细胞， 在培养基细胞悬液每次吸30〜40个细胞） 。 9. 用同一个微管从细胞洗涤液中吸取少量体积的洗涤液，转入P C R 管裂解液中作为空 白对照。 10. 当所有P C R 管准备好后，在层流罩下同时加人P C R 反应试剂，并加入5〇4 P C R 油 或液体石蜡，点离。储存在一70°C 待用。
    11•将P C R 管在65°C 热盖下孵育15〜30min，冷却到室温，加 15W 中性缓冲液于反应体 系中(加入到油或液体石蜡面以下） 。如果需要，可在一70°C 储存数月。

    来源：丁香实验

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