用表面工程慢病毒载体耙向造血干细胞

用表面工程慢病毒载体耙向造血干细胞

材料

试剂

293T 细胞

抗 CD34 藻红蛋白抗体（BDPharmingen)

C a l p h o s 哺乳动物转染试剂盒用于磷酸钙介导的转染（Clontedi)
Cellgro 培 养 基（无血清培养基； Cellgenix)

DMEM 培养基含有 0. l l g / L 吡哆醇钠和维生素 B₆

D M EM 中补充 10% 胎牛血清、 100 哗/m l 链霉素< ! > 、 lOOU/ml 青霉素、 4°C 储存。

胎 牛 血 清（F C S , 无菌）

FicoU-PaquePlus (无菌； A m e r s h a m )

H e L a 细胞

造血干细胞（H S C ; 按如下方法从新生儿脐带血中纯化）

许多研究显示 HSC 存在于表达 CD34+抗原的细胞群中。脐带血中大约丨％ 的单核细胞是 CD34+ 。

N O D / S C I D 小鼠

核酸

慢病毒载体 D N A 编码一个 H I V - I 来源的自失活载体带有内在的 EFl-a 启动子

驱动绿色荧光蛋白（GFP) 报道基因。

外壳糖蛋白表达质粒

融合糖蛋白 V S V - G

激活并靶向造血干细胞的糖蛋白：① TPOHA (T P O 融 合 H A 外壳糖蛋
白）；② S C F S U x (S C F 融合 M L V 外壳糖蛋白）。

病毒结构蛋白（G a g -Pol) 表 达 质 粒（p C M V 8. 91)

神经 A 酸酶表达质粒 P C M V - N A

磷酸盐缓冲液（P B S ) , 无钙镁，无碳酸氦钠，无菌

消化试剂’

胰酶 / E D T A

I X H a n k 平衡盐溶液（H B S S )，无钙镁，无菌

仪器

C D 34+细胞分离试剂盒从 Miltenyi 含抗人类 C D 34 微珠和阻断试剂
滤 膜（〇. 45um)

流式系统能分选细胞和三色分析

流式管

MACS 细胞分离柱（Miltenyi Biotec)

MACS 分 离 器（MiltenyiBiotec)

标准组织培养试剂，包 括 100m m 、 6 孔和 48 孔组织培养板

产生能展示活性多肽的慢病毒载体

1.〇天：转染前一天，接种 2. 5X10⁶ 个 293T 细胞在 IOOmm 组织培养皿， IOmlDMEM培养。

2.1 天：用磷酸钙转染试剂共转染 8. 6ug H I V 包装质粒和 8. 6ug 慢病毒基因转运载体和两个糖蛋白： V S V - G (1,5 邱）和 T P O H A (1.5 ug)。共 转 染 TPO H A 和编码神经氨酸酶的质粒，允许从生产细胞中有效地释放病毒。否 则 ，载体颗粒将通过 H A 外壳和唾液酸受体的相互反应来结合生产细胞。

3.2 天：转染后 15 h ，用 6m l 新 鲜 Cellgr◦ 培养基替换培养基。
该培养基适于培养 CD34+细胞和允许细胞因子展示在载体表面以保持功能。

4.3 天：转染后 36 h ，收集载体，用 0.45f x m 膜过滤，保存在一 80°C 。载 体 能 储 存 2——3 个 月 。

人类 CD34+细胞的免疫选择

5•用 P B S l : 1 稀释挤带血（C B ) , 在 50m l 管中轻柔地将 35m l 稀释血置于 I5 m I FicollPaque Plus 之上。

6.20°C , 850 g 离心细胞 30m i n ，不刹车。收集含单核细胞的层。
单核细胞是位于 Ficdl 层顶部的白色的带。

7 . 用 ？83 和 2%? 〇 3 洗涤收集的单核细胞， 20℃， 850g离心 10min。

8.用 PBS 和 2% FC S 以 IX lO⁸〜2X10⁸ 个的浓度重悬细胞。根 据 制造商的指导加抗人类 CD34+微磁珠使细胞带有磁性。 4°C 孵育并振动 30 min。

9•洗细胞去除未结合的抗体，用 PBS/2% FCS 重悬细胞。

10•用 200ul P B S / 2 % F C S 洗 M A C S 分离柱。将标记细胞加到柱子上并放在 M A C S 分离器里。允许未标记细胞通过柱子。用 P B S / 2 % F C S 洗一次。从分离器上移除柱子以洗脱 CD34+细胞。重复该步骤一次。

CD34+细胞的纯度通常是 9 0 % 〜9 5 % 。

滴度确定

11•前一天：以 2 X IO⁵ 个/孔 将 H eL a 细胞接种在 6 孔板中，终体积 2 ml DMEM/孔。孵育过夜。

12.0 天：加一系列稀释的载体制备物到 H e L a 细胞中并孵育过夜。

13.1 天 ：用 2 ml 新 鲜 DMEM 替换细胞培养基，孵 育 72 h。

14.3 天 ：消化细胞转到流式管。通过流式确定 G F P 阳性细胞的百分率。

感染滴度表达为转导单位（TU) /ml, 通过如下公式计算：
滴度= % G F P 阳 性 细 胞（感染时的细胞数/100) X 稀释倍数
多 重 感 染 度（moi) 是感染性颗粒与靶细胞数的比例

人类 CD34+细胞转导

15.以 5X IO⁴个/孔在 48 孔板中接种 C D 34+ C B 细胞， C e U G r o 培养基。以 2 0 或 4 的多重感染度转导新鲜的慢病毒载体上清。孵 育 24 h 。

16.用 C e l l G r o 培养基洗涤和重悬转导的细胞。孵 育 48 h 。用 抗 C D 34-P E 抗体免疫标记细胞，通过流式分析 G F P 表达以确定转导效率。

NOD/SCID 复检

17•转导 T P O H A 展示、 S C F S U x 展示的慢病毒载体 24 h 后 ，为静脉注射非致死性的放射 性（3.5 G y ) C D 3 4 + C B 细胞到没有体内细胞因子给药的 N O D /S C I D 小鼠。

18.移植后 6〜8 周后从股骨收集骨髓。

19•在 N O D / S C I D 骨髓中用抗-h C D 45-C y C h r o m e 、抗-h C D 19-P E 、抗-h C D 14-P E 、抗-h C D 13-P E 和抗-h C D 34-P E 抗体，应用三色流式检测不同种系的 G F P + 人类细胞。
在所有的情况下， P E 偶联的小鼠 IgG 对照应用于评估专一性标记。