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SFV-1 载体的制备

相关实验:猿空泡病毒 1 型载体

最新修订时间:

材料与仪器

步骤

SFV-1 载体的制备

材料

试剂
CaCl2 (2m o l /L )

氯 嗟(50m m o l /L )

完 全 D M E M 培养基,含 1 0 % F B S 、 2m m o l / L L -谷氨酰 胺 、 l O O U /m l 青霉素、

100ug/ml 链霉素

胎 牛 血 清(F B S )

2XHEPES 缓 冲 液(HBS; 50 mmol/LHEPES、 O.78 mmol/L Na2 HPO4 和273 mmol/L NaCl)

H a n k 平衡盐溶液(H B S S )

人类胚肾纤维原细胞来源的 293T 细胞
每 隔 3〜 4山 将 细 胞 以 1:5传 代 。 293丁细胞从八丁0:获 得 (0 ^ 1 5 7 3 ) 。 仪器 Apollo 离心浓缩棒(70k D a ; Orbital Bioscience, Topsfield, Massachusetts) 培养瓶' ( 25Cm2 和 75cm2) 滤 器 ((X45lLim,无菌包装,低蛋白质结合力, Millex-H V , Millipore) 倒置荧光显微镜 注 射 器 (IOml) 组织培养板(6 孔 和 24孔) 离 心 管 (conical, 15ml 和 50ml) 离 心 管 (1.5m l ,螺丝帽; Sarstedt) 方法____________ ___________________ ___________________________________ 用磷酸钙沉淀法转染DNA 1•转染前一天,每个75c m 2培养瓶接种5X 106个细胞。 转染当天,细胞密度应达到8 0 % 汇合。 2•用 2_634m l (263知1) H zO 稀释 12f z g S F V - l 载体、 12M g p C I g a g 、 6吨 pCIpol、 2吨 p C I e n v 0 用 超 纯 水 (autoclaved, Millipore)。 3. 加 366M12m o l / L CaCl2至 D N A 混合物并混勻。力 n 3m l 2 X H B S 到 D N A -CaCl2混合 液 ,室温放置lOinin。 4. 制 备 25p m o l /L 氯喹溶液:加 4M1 50m m o l /L 氯喹到6m l 完 全 D M E M 培养基中。用 6m l 这种氯喹溶液替换培养基。 ;•用枪头混合D N A -CaCl2- H B S 溶液,并产生I O s 的气泡,然后立即加到细胞中。 •孵育6〜8h 后 ,弃掉培养基,用 含 l O m m o l / L 丁酸钠的完全培养基代替。 丁酸钠处理不应超过24h , 丁酸钠能增加载体产量( TanakaetaL 1991)。 ,毒载体的收集和浓缩 第二天早晨,用 6. 5m l 含 3m m o l / L 丁酸钠的新鲜完全培养基替换培养基。
至 少 80%的细胞应表达G F P , 可以直接从一个倒置荧光显微镜观察到。通 常 在 转 染4〜5d 后收集上清。 8.确定载体滴度:感染新鲜的293T 细胞,计 算 G F P 阳性细胞。 通 常 ,能 产 生 IO7个/m l的 SFV-I 载体颗粒。载体能在4 C 保 存 2 周而不会有明显损失。冻 融一次会导致载体浓度丢失10倍 。 9•为了增加转导效率,用离心柱将S F V -I 上清浓缩100倍 。将病毒上清以4000g 离心 2〇 m in,除掉细胞碎片,用 0.45M m 的滤膜过滤。 10.将过滤后的上清加到70k D a 的 A p o 丨 Io离心柱,室温离心30m i n 。病毒可在4°C 短期 保存,或一80°C 长期保存

来源:丁香实验

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