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材料与仪器

外周血
RPMI 15% FBS 完全培养基 二氧桥丁烷 秋水仙胺 KCl 固定剂
注射器 组织培养瓶 离心管 离心机 倒置显微镜

步骤

1.从配有 18 1/2 G 针头的 10ml 注射器中滴入外周血(18~25 滴;0.4~0.5 ml) 至已盛有 10ml RPMI/15% FBS 完全培养基的 25 cm2 组织培养瓶中。配置两份培养基为 DEB 研究,两份作为未处理对照(共 4 份)。孵化培养基 24 h(附录 31)。

2.分装 PBS 至 3 个 15 ml 离心管中:第 1 管 10 ml,第 2 管 6 ml,第 3 管 4.5 ml。

3.在加培养基之前,先加 10 ul 常用的 DEB 至第 1 管,加盖,混匀。从第 1 管中转移 4 ml 至第 2 管,加盖,混匀。从第 2 管中转移 0.5 ml(500ul) 至第 3 管,加盖,混勻。

4.从第 3 管中各取 25 u1 溶液加入两个已孵化了 24 h 的外周血培养基中(从第 1 步;培养瓶中的最终浓度为0.l ug/ml。)。再孵化 48~72 h。

5.每 10ml 培养基中各加人 1ul/ml 的秋水仙胺 2 ml,孵化 20 min。

6.将每个培养基培养瓶中的液体转移到 15 ml 圆锥形底部的离心管中,加盖,150 g 离心 10min。

7.去掉大部分上清液,用手指轻弹离心管,使剩余上清中的片状沉淀物重新处于悬浮状态,小心地加人预热的 0.075mol/L Ka5 ml,使细胞膨胀,但不要使其破裂。在 37°C 水浴槽中孵化 10 min。室温,150 g 离心 10 min。

8.去掉上清,轻轻地加入 1 ml 新鲜的固定剂,不要把沉淀冲起来。去掉固定剂,重复这一步。

9.立即用食指弹击管壁几次,使片状沉淀物碎裂。迅速加入固定剂使细胞悬浮,防止其成块。终体积为 8~10ml。用 Pasteur 移液管打散团块。室温静置 30 min。

10.室温,150 g 离心 lOmin。去掉上清,留下 3~5 ml,使片状沉淀物悬浮。室温静置 lOmin。可立即重复这一步一次或两次,也可以让固定剂中的细胞在室温下过夜以后进行。

11.室温,150 g 离心 lOmin。去掉上清,打散沉淀,加入适量的固定剂(0.25~0.5 ml),使其达到一个理想的浓度用于制片。

一个理想的细胞浓度能使绝大部分细胞在一个显微视野中,没有拥挤的中期伸展。

12.从一个适当的高度,滴下几滴细胞悬液于清洁的玻片上,使中期分裂相能很好地散布(单元 4.1),一瓶培养基最少要制作 6 块玻片(推荐使用非诊断用的细胞去练习)。

这一步是成功的关键。

13.在倒置显微镜下观测玻片,确定中期分裂相的质量和数量。用吉姆萨将玻片染色 (支持方案 2)。

14.每一个 DEB 处理的标本分析 50~100 个用吉姆萨染色的中期分裂相(对于高度断裂的情况分析 25 个中期分裂相;附录 3K)。对染色体进行计数,并记录结构异常的染色体的数目和类型。如果断裂的染色体超过了上面的正常范围,分析未处理的标本。分析完成后对异常的细胞进行照相。

15.根据已出版的结果作为基础和 PHA 刺激下,夕卜周血淋巴细胞中 DEB 诱导染色体断裂情况下解释结果。

表 8.7.1 显示了从正常和受影响的个体中得到的基线和处理培养数据

支持方案 1 二氧桥丁烷的使用和处理

DEB(1,3-双环氧丁烷)为潜在的致癌物质,处理这种化合物时,必须采取一些防范措施。这一部分阐述的是如何使用和恰当地处理废物。

工作空间。凡用到 DEB 的操作必须在化学通风橱或者 n 级生物学安全工作橱中完成。在使用 DEB 时要穿实验工作服和戴手套。手上随时准备一瓶 6mol/L HCl(50 ml),一旦 DEB 不小心倒出来马上将其灭活。

细胞培养。有 DEB 参与的细胞培养操作应该在 n 级生物学安全工作橱中完成。细胞被固定后,操作就可以在安全橱外进行了。用 6mol/LHCl 处理废弃的培养基和清洗液,并视其为危险生物废物。以前使用过的移液管和培养瓶应该用 6mol/L HCl 冲洗,并放在高压危险生物袋中。微量移液吸头也应该丢在盛有 6mol/L HCl 的小瓶内。

废物处理。DEB 原液应该当作危险的化学废物来处理,而不能采用稀释或化学灭活的方法。使用过的塑料器具应该用 6md/LHCl 冲洗并丢入高压危险生物袋中。培养基和清洗液也应该用 6mol/LHCl 处理,并作为危险生物废物来处置。

支持方案 2 用于染色体断裂分析的吉姆萨染色

吉姆萨染色是一种组织学染色,对细胞核和染色体有特别的亲和力。制作简单,使未显带的细胞核和染色体成微红色到紫色。

1.将一片 pH6.8 的 Gurrs 缓冲液溶于 1L 水中。

2.加入 4 ml 新鲜的吉姆萨染液至盛有 46 mlGunrs 缓冲液的染缸中。染液可使用 1h 或染 20 块玻片,然后就要配置新的染液。

3.将中期染色体玻片染色 5 min。在盛有 Gurrs 缓冲液的染缸中浸洗几次(第 1 步)。

4.在盛有水的染缸中浸洗几次。空气中干燥,检查玻片的染色强度。

染色强度应该足量,而染色体上的裂痕和断裂区又不易染色(非染色)。

5.使用 Permount 组织封固剂将盖玻片加载于载玻片上。

备选方案 1 成纤维细胞培养二氧桥丁烷试验

如果外周血不能获取,可以通过皮肤组织活检成纤维细胞培养来进行试验。也可以从流产儿或死产儿中取几小片肺组织或皮肤来进行试验。因为较高浓度对 FA 成纤维细胞有太大的毒性,很难收获足够多的中期分裂相来进行研究。

1.将 0.5 ml DMEM 完全培养基/20% FBS 溶液中的活体组织放于一块 60 mm 组织培养皿上,并用无菌手术刀将其切割成片,1 mm 大小。

2.另取最少三块 60 mm 组织培养皿,用无菌手术刀尖在皿底划上几条水平线和垂直线。滴几滴 DMEM 完全培养基/20% FBS 溶液至活体组织片上。在每个 60 mm 组织培养皿上用无菌 Pasteur 移液管放上 5 或 6 片活体组织。将组织放在水平线和垂直线的交叉点上。

3.孵化培养皿,不要加任何其他组织培养基,15~30 min,使组织片黏附在皿上。加 5 mlDMEM 完全培养基/20% FBS 溶液至每块培养皿中,孵化培养基。

4.每 3~4d 更换一次培养基,但不要扰乱组织片。使用倒置显微镜观察培养基中细胞的生长状况(得花上 1 周至 1 月才能观察到生长较好的细胞)。

5.当培养皿中的组织片周围能看到大片的成纤维细胞时,用 1X 胰岛素/EDTA/15% FBS 处理细胞,进行传代(附录 31),注意当活体组织能够继续在培养基中生长时不要将它们取出来。将细胞转移至盛有 DMEM 完全培养基/15%FBS 的 25 cm2 无菌组织培养瓶内。

6.当第一代细胞长满后,再次用胰蛋白酶处理(附录幻)。次代培养按1:3 分装至 DMEM 完全培养基/15% FBS 溶液中。为 FA 患者进行 DEB 试验时,至少有两个第二代培养基中长满细胞。

7.用 5 ml DMEM 完全培养基/15% FBS 溶液将细胞接种在 25 cm2 培养瓶中,使每个培养瓶中细胞的密度达到 3X105 个细胞(为本次检验准备两个处理的和未处理的对照培养瓶)。孵化 24 h。

8.将 DEB 按以前所描述的那样稀释(基本方案,第 2~3 步),再增加第 4 管,分装 PBS 4.5 ml。成纤维细胞培养还要增加最后一步稀释,即从第 3 管中取出 0.5 ml(500ul 加入第 4 管中。

9.从第 4 管取出 254 加入到 10ml 新鲜的 DMEM 完全培养基/15% FBS 溶液中。

10.培养细胞直至细胞接近长满(约 72 h)。

11.胰酶消化细胞(附录 31) 按 1:2 或 1:3 传代到新鲜的完全 DMEM/15%FBS 培养基。该培养基不含 DEB 用于收集充足的有丝分裂细胞来进行细胞遗传研究。重新加入限制性培养基,该培养基含有鲜好、稀释的 DEB。

12.于第一个有丝分裂时段收集培养的细胞(传代 24~48 h; 这时细胞处于有丝分裂中期附近),在收集细胞前 3 h,加入 1ml 浓度为 1ug/ml 的秋水仙胺到 DEB 处理的细胞中,同时用未用 DEB 处理的细胞作对照(于 5 ml 培养基)。

13.用胰酶消化细胞,将培养瓶内的液体转移至 15 ml 无菌的离心管,加盖,150 g 离心 10min。

14.去掉大部分上清,使剩余上清内的沉淀重新悬浮,并慢慢加入 0.051mol/L 的 KCl 5 ml。在 37°C 水浴箱中孵化 lOmin。离心 lOmin。

15.像前面叙述的那样将细胞固定在预备好的载玻片上(基本方案,第 9~12 步;在第 9 步,缓慢加人 3~5 ml 固定液)。

16.检验 100 个未处理和 DEB 处理后吉姆萨染色的中期分裂相细胞,找断裂染色体,方法如前所述(基本方案,第 13 步,支持方案 2)。根据在 FA 患者成纤维细胞中为基线和 DEB 诱导的染色体断裂所建立的评估来解释结果。

备选方案 2 范可尼贫血二氧桥丁烷产前诊断试验

FA 可以在妊娠时诊断,但有一定风险,在怀孕 9~12 周时通过培养绒毛绒膜取样 (chorionic villus sampling,CVS) 获得滋养层细胞或者在 15~17 周时羊膜穿刺获得羊水细胞进行研究。FA 也可以用胎儿血液进行产前诊断,方法与以前的外周血培养相同。

研究 CVS 或羊膜穿刺获得的胎儿细胞

1.在 25 cm2 的培养瓶内配置胎儿细胞培养基(单元 8.1 和单元 8.2)。

2.当培养瓶内有几个大的、生长迅速的克隆时,不要让克隆过度的生长,用胰酶消化细胞,按 1:2 或 1:3 进行首次传代培养(附录 31)。孵化 24 h。

3.用自有 0.01 ug/ml DEB 的新鲜生长培养基置换生长培养基(从两个不同的首次传代培养基中)至最少两个培养瓶中。可能的话,用含0.1ug/ml DEB 的培养基置换首次传代的培养基至另外两个培养瓶中,稀释与以前相同(备选方案丨,第 8~9 步)。

剩余培养瓶中的液体作为染色体断裂研究基线的未处理对照。

4.孵化培养基,收获并固定细胞,如之前叙述的那样准备中期染色体涂片(备选方案 1,从第 10 步开始)。

5.每组共检测 100 个中期分裂相(基线组,DEB 处理组;每组分别从两个首次传代培养瓶中各取 50 个中期分裂相)。根据针对通过 CVS 或羊膜穿刺获得的 FA 胎儿细胞所制定的基线和 DEB 诱导的染色体断裂所建立起来的评估来解释结果。

来源:丁香实验

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