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    基本方案2 羊水细胞间期核细胞分析实验

    相关实验：羊水细胞用于间期核 FISH 分析的制备方法实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    附有羊水细胞的载玻片或盖玻片
    2X SSC 乙醇 变性溶液 生物素或地高辛标记 DNA 探针 杂交溶液 甲酰胺洗涤液 PN 缓冲液 荧光素标记的抗生物素蛋白 生物素化的抗生物素蛋白抗体操作溶液 DAPI 染色液 二碘化丙锭 苯二胺氟安定抗退色封固剂
    载物片加温器 水浴箱 玻璃盖玻片 胶布 保湿室 荧光落射显微镜和用来设置恰当荧光的滤光片

    步骤

    1. 于 37° C 水浴箱，在盛有2X S S C 溶液的染色缸里，将附有羊水细胞的载玻 片摇动l h 。 ^ 巍玻 2 . 在 盛 有 7 0 % 、冰水预冷的乙醇染色缸中漂洗玻片2rnin。 每块玻片继续在 q/ 100%冷乙醇中脱水2m i n 。让玻片于室温空气中自然干燥。 ‘ 0和 3. 于 72°C 水浴箱，在盛有刚好70°C 变性溶液的染色缸中准确地摇动2 m i n (加—地 后 ，就将水浴箱温度升高1°C )。 这一步是成功的关键。 4. 重复第2 步。将变性后的玻片在载物片加温器中预热至37。 〇，直至杂交。 用于CT 卫星重复DNA探针 5a. 于 37°C 水浴箱，在 I.5m l 微 量 离 心 管 中 预 热 『卫 星 D N A 探针 液 5m i n 。 又俗 这一步所用的重复D N A 探针通过商业途径获得。在这一过程中为了特别 要而进行一些探针的修饰提到了产物数据表。实验室关于不同的探针应用和 探 二 标记方案参见单元4. 4 中的详细介绍。 6a. 每块玻片在杂交时，在一个新的微量离心管中混合L 预热的探针和3〇 ^预 热 杂交溶液。 ' 7^在一个7〇(3水浴箱中孵化探针/杂交溶液混合液5111丨 11，使探针变性。迅速在冰上冷 却 至 4°C 。 稍微地旋动一下， 然后以最大转速离心2〜3s。 8a. 用 3I .¥ 探针/杂交 溶 液 混 合 液 （1 5 n g D N A ) 使 在 第 4 步中制作的每块玻片上的 染色体变性。用 24m m X 50m m 的塑料盖玻片盖住混合液，用较轻的压力将气泡赶 走 。用胶带密封。于保湿室37。 0 过 夜 （14〜18}1) 孵 化 （ 单 元 4.4)。 尽管这一过程称为过夜孵化，但 在 利 用 星 重 复 DNA 探 针 时 ，杂交的时间 可缩至2〜4h。 9a. 于 43°C水浴箱中，在 盛 有 6 5% 甲 酰 胺 洗 涤 液 的 染 色 缸 内 ，断 断 续 续 洗 涤 玻 片 15m i n〇进 人 第 10步 。 用于预先包装好的单一序列探针 5 b .取 IOm I 10〜100n g/M l包装探针至I.5m l 微量离心管内，用于与每块玻片杂交。
    商业化的单一序列探针成套的预先与封闭的（ Cot-1) D N A 和 50% 甲醜胺杂交 溶液进行了混合。许多商业化的单一序列探针（ Oncor) 不要求变 性 。 6b . 在一个37°C 水浴箱中，孵化包装探针5min。 在这一过程中为了特别的需要而进行一些探针的修饰提到了产物数 据 表 。 实验 室关于不同的探针应用和探针的标记方案见单元4. 4 中的详细介 绍 。 7b.用 IOfjJ 包 装 探 针 （10〇 〜 iooong D N A ) 使 第 4 步每块玻片上制作的染色体变性。 8b. 用 24m m X 50m m 的塑料盖玻片盖住混合液，用较轻的压力将气泡赶走。用胶带密 封。于保湿室37°C 过 夜 （14〜18h ; 第 8a 步中的注释）孵化。 9b . 于 43°C 水浴箱中，在 盛 有 5 0 % 甲酰胺洗漆液的染色缸内，断断续续洗漆玻片 15m i n 。进人第1〇步。 10. 37°C 水浴，在盛有2X S S C 的染色缸内，间断地洗涤玻片8min。 11. 室温下在盛有P N 缓冲液的染色缸中简单地冲洗玻片。从染色缸中取出玻片，弄掉 过多的液体但不要让玻片干掉。 12a. 生物素标记探针：用 60； j J 卵 白 素 去 杂 交 每 块 玻 片 上 的 染 色 体 标 本 。放置一块 24m m X 50m m 的塑料盖玻片盖住溶液，用较轻的压力将气泡赶走。于 37〇c 保湿室 孵 化 20m i n 。 12b. 地咼羊标记探针：用 60juJ突光素结合羊抗地高辛F a b 片段去杂交每块玻片上的染 色体标本。放置一块24m m X 50m m 的塑料盖玻片盖住溶液，用较轻的压力将气泡 赶走。于 37°C 保湿室孵化20m i n 。 13.依次在三个独立的盛有P N 缓冲液的染缸中间断地洗涤玻片2m i n。 W a . 扩大生物素标记探针信号（ 如果需要） ：用 604 51^1/)^的生物素化的抗生物素蛋 白抗体去杂交每块玻片上的染色体标本。放置一块24m m X 50m m 的塑料盖玻片盖 住溶液，用较轻的压力将气泡赶走。于 37°C 保湿室孵化20m i n 。重 复 第 13、 12a 和 13步。 M b . 扩大地高辛标记探针信号（ 如果需要） ：用 60^15/^1/1111带有荧光素标记抗兔抗体 的兔抗羊抗体，根据需要在步骤之间进行洗涤。 一些情况下可以获得弱信号，可能需要进行第二轮信号扩大，这些片子需要 重 复 第 1 4 步的操作。 15. 用 2 1 4 2；xg/m l的 D A P I 染 色 液 和 2 14 2pg/m l的碘化丙锭去杂交每块玻片上的染 色体标本。在暗室中室温孵化5min。 D A PI能提供最佳的细胞形态，而在中期分裂相碘化丙锭能提供一个一致的红 色背景，从而便于观察黄-绿色荧光信号。 1 6 . 在一个盛有P N 缓冲液的染色缸中冲洗玻片3 m i n ， 去除过剩的染液。 17•用21^x1苯二胺氟安定抗退色封固剂去杂交每块玻片上的染色体标 本 。 用一个 2 4 m m X 60m m 的玻璃盖玻片盖住。 1 8 . 用荧光显微镜检查玻片，对能提供有意义结果的细胞照相。对每个所使用的探针每 5 0 个细胞计数杂交信号的数量，来分析中期核细胞。

    来源：丁香实验

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