外周血培养和分裂中期细胞收获实验

基本方案 外周血培养和分裂中期细胞收获

1.应用含有肝素钠的 Vacutainer 或含有 25U/ml 血的无防腐剂肝素钠（不要应用其他抗凝剂）的注射器，经静脉穿刺采集外周血。尽快开始培养（推荐），或 4°C 保存不超过 4d。室温运输。

2.用带有 21 G 针头的 TB 注射器，接种 0.25 ml 全血至无菌 15 ml 聚丙烯离心管，内含 5 ml 完全 RPMI，其中含有 10%FBS 及庆大霉素。<3 周的新生儿加全血 0.2 ml，任何一管中都不要超过 0.5 ml。加人重新溶解的 100XPHA0.05 ml。

每培养管可制作 3~5 张铺满的玻片（或更多张未铺满的玻片）。

3a. 标准样品：培养管倾斜 45°(—定的角度有利于空气交换并防止沉淀堆积）培养 2~4d(最佳 3d)。

3b. 新生儿：如描述的直接收获或培养 1~2d 后收获（2d 最佳)。

3c. 老年人：此年龄组的淋巴细胞对 PHA 的反应较慢，因此在培养 3~4d 后收获。

4.可选方案：对于较长的染色体和更多的有丝分裂细胞，应用以下的方法（图 4.1.1) 可获得更好的同步化细胞。收获前一天，加人 0.05 ml 的 10 mmol/L 氨甲蝶呤（终浓度为 10—7mol/L) 以阻断 DNA 复制。继续培养 16~18 h(不超过 18 h)。第二天，加入 0.05 ml 的 lmmol/L 脱氧胸嘧啶核苷（终浓度为 10-5mol/L) 以解除氨甲蝶呤的阻断作用。继续培养约 4 h(时间是关键因素）。

5.培养 3~4d(第 3 步），或同步化（第 4 步）后，直接加入 lOug/ml 秋水仙素 25ul (终浓度为 O.OSug/ml)，启动收获，孵育 30 min。室溫 180 g 离心 8 min，弃上清。

6.于室温加入 75 mmol/LKa 溶液 6 ml，并轻轻地使细胞重悬。室温静置 15 min，根据沉淀物体积调整 KCl 体积以达到最佳条件，比延长时间更有效。

7.用巴氏管加入固定剂 10~12 滴，混匀。离心，同第 5 步。

8.保留 0.5 ml 上清，利用巴氏管轻轻吹吸，使棕色的块状物重新悬浮。避免吸入过多而使其黏附于玻璃管上。勿将吸管前端紧压管底。加入 1 ml 固定剂并立即轻轻混匀，以固定剂调整体积至 5 ml 并混匀。离心，同第 5 步。

9.弃上清，以 5 ml 固定剂重悬沉淀物，离心，同第 5 步。

10.弃上清，以适当体积固定剂重悬沉淀物至类似稀牛奶的混悬液。室温静置 30 mm，或 4°C 过夜（较长固定时间有利于染色体分散)。

11.制片，分析分散开的染色体（支持方案)。

支持方案 染色体玻片制备

此方法适用于多种方法培养的细胞：外周血、骨髓（单元 10.1)、腹水、胸水、羊水（单元 8.2) 和培养瓶收获细胞（单元 8.1、单元 8.3 和单元 10.2)，杂交或放射杂交体细胞（单元 3.1)，淋巴细胞株，非人类的杂交瘤细胞。总之，该方法适合于任何经培养、固定的有丝分裂细胞悬液制备染色体玻片。

1.从甲醇中取出玻片，用不含棉的绒布擦净（玻片务必洁净）。再次将玻片浸人甲醇，然后以去离子水反复冲洗，直至将甲醇冲净，并且在玻片表面留有均匀的一层水膜。

2.以拇指和食指拿住玻片磨砂的一端，倾斜玻片使其长边与工作台面平行，用吸水纸接触玻片下侧长边，吸干玻片上多余水分。使玻片倾斜于工作台面呈 30。角，并使玻片下侧的长边与吸水纸保持接触，有水层的一面向上（图 4.1.2)。

3.水平持巴氏管于玻片上方 1~2in 处，连续、均匀滴加细胞混悬液 3 滴，移动方向朝向磨砂一端。每一滴平均占有玻片的 1/3 宽度，滴在倾斜玻片上的液滴，在其接触到玻片的同时拨散开来。如果细胞分散的面积集中在液滴滴下位置，液滴周围细胞较少，则应在滴片时减小玻片与工作台之间的角度（<30°)

4.吸去多余的固定剂，按照第 2 步使玻片倾斜 30°，滴加新鲜配制的固定剂，用巴氏管一滴一滴地滴加。从抬高的无磨砂的一端开始移向磨砂的一端，滴在玻片抬高的边缘，形成均匀的固定剂的前端。

5.再次吸干玻片下侧长边边缘水分，并将玻片背面擦干。将玻片磨砂端向上倾斜 30。，滴有细胞的一面向上，于空气中晾干，使其充分分散。如果玻片周边细胞分散效果不佳，可参见表 4.1.1 操作（如调整温度为 20?22°C，相对湿度为 50%)。

6.在相差显微镜下寻找形态及分散良好的染色体观察。祧选染色体分布均匀、一致、密度适中且没有染色体相互重叠的玻片，为了利于获得理想的染色体条带或杂交信号，理想的染色体应平整、条带分明、着色一致。

7.玻片储存在清洁、干燥、阴暗处，室温（短期）或一 70°C 冻存（长期）保存。