干 细 胞 的 保 存 与 复 苏

一、造血干细胞的低温保存方法

胎肝造血干细胞的低温保存方法

1 ) 胎肝细胞悬液的制备

人胎肝取至水囊引产或剖腹产的4〜6个月正常胎儿。在无菌条件下从腹腔取出胎肝，同时从心脏取血查胎儿血型。剔除粘连在肝脏表面的结缔组织和胆囊后，将肝脏置于培养皿中剪成小组织块，然后投入装有双层不锈钢(内层孔径为 1 0 0 目，外 层 为 1 8 0 目/in²(lin²=6.451600xl0^-4 m ²))的小烧杯。用少量培养液或生理盐水(经细胞培养，热原试验均为阴性)，将组织块冲洗2〜 3 次 ，弃去洗涤液，然后倒入20 ml P R M I 1640培养液，并用注射器针芯在钢网内将组织块研磨，如此 重 复 3 次 ，即可取出胎肝中绝大部分的造血干细胞。将合并收集的细胞悬液通过4 号针头的注射器制成单细胞悬液。

2 ) 冷冻保护液的添加

用 1640培养液将无菌的保护液 (DMS〇 )配 成 20 % 浓 度 ，取与胎肝悬液等体积的2 0 % D M S O , 缓慢加人细胞悬液中，室温静置 10min ，再将样品放入降温仪中。

3 ) 降温方法

程序降温法：多采用两步或三步降温法，即 开 始 时 从 室 温 以 降 温 ，降至- 3 0 ℃时 ，恒 温 2m i n 后 改 为 5——7℃ /m i n 降至-80℃或- 9 0℃ ， 再转入液氮中 ( - 1 9 6 ℃ ) 长期保存。也有人主张开始降温速度应严格控制在1-3℃ /min，但经过相变(-11—15℃)热释放之后即可加速降温速度，余下各阶段对细胞存活影响不大(刘金刚1993)。

骨髓造血干细胞的低温保存方法

1 ) 骨髓的采集

骨髓应在手术室内行无菌操作。患者在局麻或全麻下，用骨髓穿刺针在前、后进行多处穿刺抽取骨髓。抽取骨髓用的注射器应肝素化，控制每毫升骨髓的肝素量为20——40单 位 ，以防形成凝集。



外周血造血干细胞的低温保存方法

外 周 血 的 采 集

恶 性 血 液 病 患 者 采 用 C M O P 化 疗 联 合 rhG-C S F (每日l〇ng/kg)动 员 ，白细胞升至5xl0⁹ 个/L 以上时，采 用 C S -3000 P L U S 血 细 胞 分 离 机 采 集 P B S C ，处理血循环总量7000——16 OOOml(根据患者情况设定)，总 产 品 55——60 ml。

冷 冻 方 法

目前外周血造血干细胞体外保存主要有两种方法 ： -196℃ 程控降温液氮冻存和- 8 0 ℃ 直接保存方法。其中前者以其能长期保存而且细胞损失少作为经典方法在国内外广泛应用(Almid 1997, Broxmeyer 1997)，但缺点是操作复杂，仪器设备昂贵。 - 8 0℃ 直接冻存的方法是从2 0 世 纪 8 0 年代发展起来的，其优点是操作简便，费用低而实用，但用该方法进行长期造血干细胞保存研究报告较少，故目前认为-80℃ 直接冻存适用于较
短时间的造血干细胞冻存。冷冻保护液是影响冻存效果的关键之一。

程控降温，液氮保存

程控降温指降温过程采用程序控制，程序结束后将 P B S C 置入液氮中保存。此时所有的酶活性均被抑制，环境中的射线也不会对细胞造成电离损伤，可较长期保存。该技术仅以二甲亚砜 ( D M S O ) 为冷冻保护液，是经典的造血干细胞保存方法。

⑴ 配 制 冷 冻 保 护 液 ： 50% R P M I 1640营养液、 20% D M S O 、 3 0 % 人 A B 血清或自体血浆。

( 2 ) 将 采 集 的 P B S C 用 R P M I 1 6 4 0 营养液调细胞浓度在 2 x l 0 ⁷—— l x l 0 ⁸ 范围内，与等
量预冷的冷冻保护液混匀，分别注入低温冷冻袋内，并留取检测样品注入冷冻管。

(3) 将冷冻袋(管)放入已预冷至4℃程控降温仪内，程序化降温。 -l℃/min，降至-4〇 ℃，平 衡 3 min， -5℃ /min，降至-80℃ ，取出后放人液氮内(- 1 9 6℃)保存。存放时间为 5 年 。

⑷ P B S C 复苏与回输：冻存物自液氮中取出后立即放入42℃水浴箱中，完全融化后立即快速回输给患者。

(5)细胞活力测定：将待测样本分别于冷冻保存前与复苏后Oh、 3 h 、 6 h 采用台盼蓝拒染法检测细胞存活率(吕 秀 荣 2 0 0 4)。

非程控降温， -80℃保存

这是没有速控条件下的冷冻方法，简单可靠，易重复操作。但是由于这种降温方式在降温的过程中降温速度不恒定，冷冻保护液选择和其对细胞回收率的影响备受重视(彭文 珍 2003)。

1 ) 冷冻保护液

Stiff报道了以6 % 羟乙基淀粉 (H E S )、5 % D M S O 及 4 % 人血清白蛋白(A L B )混合物作为冷冻保护液，用非程控降温将骨髓细胞置于- 8 0 ℃冻存的方法。 Halle等(2004)采 用 1 %H A S + 3 . 5 % H E S + 2 . 5 % D M S O 。张俊萍等将D M S O 、 H E S 、 A L B 和 H A S 按不同比例组成冷冻保护液，发 现 5 % D M S O + 6 % H E S +H A S 效果最好。范华骅等研制的C P 8 0 低温保护 液 含 7.5% 右旋糖酐、 6.25% D M S O 和 6.25% A L B ，与样品混合后D M S O 浓 度 为 5 % 。

也有选用单一冷冻保护液的。 Galmes等(1995)首先提出以10% D M S O 为保护液，细胞冷冻后储存于-80℃的方法。 Hemandez-Navarro等 以 10% D M S O 和 H A S 混合物为冷冻保护液，将 装 有 P B S C 的冷冻袋放入9 5 % 甲醇液中，直接置于-80°C 保存，细胞回输后造血恢复情况与其他方法无明显差异。叶韵斌等(2000)对 使 用 10% D M S O 单一保护液和 5 % D M S O + 6 % H E S + 4 % A L B 混合保护液的效果进行比较，发现在冻存180天以内二者差异不大，细胞活力在8 5 % 以上， C D 34+阳性细胞比例、粒单集落数均维持治疗水平。

2 ) 细胞浓度

临床冻存 P B S C 常采 用 0.5xl0⁸—— 1.0xl0⁸个/ m l 的细胞浓度。

非冷冻保存

McElwain、 Mangalik、 Bumett等分别将骨髓造血干细胞在 4°C保 存 8 h 、 72 h 和 48 h后进行回输，并取得了成功。非 低 温 4 ¾ 保 存 P B S C ， 简化了移植过程，无需加入冷冻保护 液 ，避免冻存过程对细胞的损害，仅需要骨髓保养液，可减少回输时的毒副作用；减少 P B S C 在体外污染的机会；有利于造血重建。因此它是一种简便可行，安全可靠，经济有效的体外保存方法。缺点是保存时间较短，不 宜 超 过 72 h ，当预处理方案为3〜 4 天

脐带血造血干细胞的低温保存方法

脐 带 血 的 采 集 与 分 离

1 ) 脐带血的采集

用密闭式收集法采集顺产或剖宫产的新生儿的脐带血。孕妇年龄小于3 5 岁 、足月妊娠 、无并发症、产前血液检查H b >90 g/L 、病 毒 检 测 HbsA g 、 H C V 、 anti-HIV1/2 抗体、梅 毒 阴 性 。孕 妇 及 丈 夫 均 无 遗 传 性 疾 病 家 族 史 。采用枸橼酸 钠 腺 嘌 呤 保 护 液 (citratephosp 上 ate dextrose adenine， C P D A ) 抗凝的密闭式血袋在胎盘娩出前从脐带断端远离新生儿侧采集。、采集后室温保存， 18 h 内运输至脐带血保存库。

2 ) 脐带血的分离

米 用 6 % (质量分数) 轻乙基淀粉(h e s ， 平均相对分子质量 480 000， H e s p a n ， D u p o n ,美国) 沉降后一次离心方法去除绝大多数红细胞及大部分血浆。具体方法：每份脐带血按体 积 比 1 : 4 的比例加入脐带血内，充 分 混 勻 ，垂 直 倒 置 悬 挂 ，使红细胞自然沉降20〜 3 0 m i n ， 直至红细胞界面不再下降时，去除红细胞。再将富含有核细胞的血裝在 1〇℃ 4 00g 离 心 l O m i n ， 沉降有核细胞。用血浆积压器去除部分血浆。体 积 为 30——40ml。以上操作均在采集袋中操作 (刘 开 彦 2 0 0 3)。

3 ) 脐带血直接保存
作者所在实验室从医院取回的脐带血未经任何处理直接加入等体积的保护液，液氮保存取得较好的效果。

冷 冻 方 法

程控降温深低温保存法

保护液配方： 2 0 % 二甲基亚砜(D M S O , Sigma 公司)， 8 0 % T C E 。在冰水浴中，将浓缩的有核细胞加入等体积的低温保护液 (D M S O 终 浓 度 为 10%)，混 勻 ，样品放入 D W 微机降温仪中，以 代 /m i n 的速度降温至-40℃ ，然 后 以 5T /m i n 的速度降温至- 8 0 ℃ 后取出，置液氮中保存，有核细胞终浓度为 (2.34±2.06)xl0⁹ 个/L (马庆2003)。

非程控降温深低温保存法

下面介绍几种不同保护液组方的保存方法：

⑴ 保 护 液 配 方 :2 0 % D M S O ，1 2 % 右旋糖軒 (dextmn，Sigma 公司)，生理氯化钠溶液。在冰水浴中，将浓缩的有核细胞加入等体积的低温保护液 (D M S O 终 浓 度 为 10%)，混 匀 ，置-80℃冰箱存放 4 h ，再置液氮中保存，有核细胞终浓度为 (2.34±2.06)xl0⁹ 个/L (马庆 2003)。

⑵ 与 脐 带 血 等 体 积 的 16 奶 培 养 液 ， A C D 保 养 液 10m l ， 20% D M S O ，混 匀 ，缓慢加入到脐带血中(D M S O 的终浓度为10%)，静 止 5 min，放入液氮气相中， 30m i n 后投入液氮。

⑶ 保 护 液 配 方 ： 10% D M S O , 1 2 % 右旋糖肝， 5 % 白蛋白，生理氯化钠溶液。冰水浴中，将浓缩的有核细胞加入等体积的低温保护液 (D M S O 终 浓 度 为 5 % ) ，混 匀 ，置- 8 0 ℃冰箱保存，有核细胞终浓度为 (2.34±2.06)xl09个/L(马 庆 2 0 0 3)。

复温

由于保存方法的不同，复温的形式有多种。

1 ) 不去除保护液

从液氮中取出样品，在 37——42℃水浴下快速复温，时间不超过 5 min。过滤脐带血，将其置入消毒过的输液瓶里，封 口 ，待患者使用。

2 ) 去除保护剂

取出样品复温，水浴温度控制在4 1 ℃ ，每份脐血均可在2m i n 内冻融。加入等体积的 5 % 白蛋白和 10% L M D 混合液，混匀平衡 5 min 后离心去 D M S O , 再 用 L M D 调细胞悬液(李 光 武 1998)。