核移植技术

核移植操作所需的主要设备与试剂

核 移 植 需 要 的 材 料 和 设 备

显微锻针仪 (配置 IOx 和 20x 物镜，包括加热及冷却元件、玻璃固定夹和立体显微镜组合)、铂铱丝、拉针仪 (在玻璃丝和控制的选择上有不同的变化)、玻璃毛细管 [分别用于持定针 (1x90m m )，去核或注射针 (外径 1.2m m ，内径 0.90m m )，以及穿刺针 (10 ul]、显微操纵器、倒置显微镜、电融合系统、显微镜加热/冷却板、 CO2 培养箱、压电微移液管驱
动单位、操作小室、转移移液管、 2 7 号针、 30m m 培养皿。

培 养 基 及 试 剂

操作用培养基： M 2 培养基 ，体外培养用的培养基， M 16 培 养 基，
透明质酸酶，终 浓 度 300 单位/m 2 的 M 2 培养基。

显微注射用的培养基：显微注射时可用 H E P E S 缓冲的培养基，如 改 进 的 B M O C -3加 H E P E S ) 再补加细胞松弛素 B (5^ig/ml)。如果注射时卵膜被拖带进细胞质 中 ，卵将可能很快裂解。细胞松弛素 B 在注射期间使膜变硬且防止卵裂解。另一种效果也类似的方法是用 7%(W /V ) 乙醇。用平台冷却装置将温度降至 I O℃ ，也能使卵膜变硬。只要在约 45m i n 内将卵再回升到 37.5℃ ：，将不改变卵的存活。冷却效应使卵膜明显变硬需 要 长 达 lOmin，因此最好采用更简单的细胞松弛素 B 的方法。

细胞骨架抑制剂：细胞松她素 B ，诺考达哩 (nocodazole); 储存液 (IOOOx) 用二甲亚砜配 制 ，保存在-20 ℃或溶解后马上冷至 4 ℃

0.25% 胰 蛋 白 酶 : 用 含 〇. 〇 2% EDTA 的磷酸缓冲液的生理盐水 (PBS) 配制，用于分裂球和细胞的消化。

灭 活 的 仙 台 病 毒 ，石 蜡 油 ， Hoechst 33342[储 存 液 (lmg/ml) 用 双 蒸 水 配 制 ]，Zimmermann 细胞融合培养基， O.3mol/L 甘露醇，芽肠霉素 (aphidicolineX 储存液(lmg/ml 佣 D M S O 配制，保存在-20℃ 或 溶 解 后 马 上 冷 至 )， P V P (聚乙烯吡咯烷酮)，P V A (聚乙烯醇，在进行直接注射时,P V A 代 替 B S A 可防止细胞质内含物黏住供体细胞)，补加锶的培养基 (附录 3)，补体 [分离内细胞团 (I C M ) 时用]，细胞增殖试剂盒 (用于检测同步化胚胎的细胞周期试剂盒)，超排卵用激素， P M S G (孕马血清促性腺激素) 和 H C G (人体绒毛膜促性腺激素)。

核 移 植 技 术 流 程 必 备 的 主 要 仪 器

主要仪器包括荧光倒置显微镜和显微操作仪。不同配置的显微镜，都应具有很好的差分干涉反差 (differential interference contrast, DIC)。 一 般 用 180〜 400 倍放大，通常显微操作的放大率为 2 〇〇 x 时才需要 DIC。 此外还有细胞融合仪、拉针仪、锻针仪和磨针仪。有关装置具体描述如下。①持针架。显微操作器厂家都提供一些持针架或管周颈圈套件。例 如 ， Leica 的持针架即为一种管周颈圈套件，将装有适配垫圈的两个黄铜配件固定，形成紧密的连接。在该组件盖有一金属螺纹帽，可对所环绕的注射针加以调节，形成一个防漏垫圈。垫圈直径应该与注射针的外径相匹，并需要经常更换，使所用的管子有效。②显微操作仪的调节装置。显微操作仪具有一些可调的刻度盘，用以调节操纵杆的灵敏度和张力。对显微操作仪上所进行的各种调节，应该请教合格的技术人员示范。③抗震
台。在显微注射针插入到卵中时，轻微的震动也会使卵受到破坏，使之裂解 (即时的或延时的) 以及使前核的定位造成困难。为避免这种失误，必须使用无振台。例如，抗振基座支 撑 起 在 4 个氮气传动活塞上的不锈钢覆盖的铅框 (或复合物或钢框)。除此之外，大多数情况下，大理石台也很不错，而且价廉。在特定情况下，实验室的位置与环境也将有一定影响作用。

进行细胞核移植时，需 要 3 种类型的玻璃工具：持定针、去核或注射针和细玻璃针。持定针可在显微手术时将卵细胞把持住，去核针用来去除卵母细胞或合子的染色体或细胞 核 ，注射针用来注射供体细胞或细胞核到卵周隙或卵质中，细玻璃针用来切割透明带以进行细胞核移植。在器械的品质材料方面：持定针要用厚玻璃管来制作。用手将毛细管的变细部或中央在火焰上加热，然后迅速拉伸。用来持定卵时，最合适的外径是与卵的直径 (80〜 1 〇〇um) 等同或稍大。可在显微镜下检查针尖是否平坦或外径是否合适。在显微镜下有助于观察并通过配有铂铱丝 (IOOum) 的锻针仪来将之定型。在锻针仪上将玻璃毛细管垂直于铂铱丝固定，稍稍进行加热。由于玻璃的熔化，玻璃毛细管末端会变小，末端结果稍稍弯曲到 30°。而细玻璃针的制作可将毛细管的变细部或中央在火焰上加热，然后用手迅速拉伸。为使针变得锋利，将玻璃毛细管垂直于铂铱丝固定，在铂铱丝加热温度较低时，将毛细管尖向下拉。此步重复 2〜 3 次即可使毛细管尖变得很细。

所有显微工具都可将末端稍与加热丝接触即略变弯曲 (约距尖端 1 mm)，要看所用的显微操作器的要求，更弯的也可在火焰上用手来做到。去核针核注射针要用薄壁玻璃管来制作。玻璃毛细管先用拉针仪拉，最后用锻针仪定型。将玻璃毛细管与铂铱丝成水平方向固定，将外径为 1 〇 〜20p m 的毛细管末端轻轻接触到销依丝末端上的玻珠，慢慢加热，毛细管末端开始熔化，形成很细的玻璃针头。注射针合适的外径应与供体细胞的直径相似或者稍小。

核移植技术的主要操作步骤

核移植技术主要包括显微操作技术和细胞融合技术，其中包括一系列复杂的程序：受核细胞的准备、去核、供核细胞的准备、细胞核移植、融合及激活、重构胚的体外培养和胚胎移植等。成功的核移植依赖多种因素，包括受体细胞的类型、受体细胞的来源、重构的方法、激活、胚胎的培养、供体细胞的类型、供体和受体细胞周期的选择等。下面按操作流程逐一介绍。

受 核 细 胞 的 准 备

迄今为止，哺乳动物核移植中用作核受体的主要有去核成熟卵母细胞和原核受精卵。以去核卵母细胞为最常用。现在越来越多的人将体外成熟卵母细胞 (M Ⅱ 期) 用作受体胞质。

以 成 熟 卵 母 细 胞 为 受 核 细 胞

M II 期卵母细胞是目前采用较多的核移植受体，只是各个实验室所采用的激活时间有所不同 (移核前激活、移核时激活、移核后延迟激活)，无论是早期胚胎卵裂球、胚胎干细胞 (embryonic stem cell， ESC)， 还是体细胞的核移植到这类受体中均可成功获得了后代。

成熟卵母细胞的获得的途径有两种：体外成熟和体内成熟。体内成熟是用超排卵的方法获得。而体外成熟培养既方便又利于大量获得，体外培养的卵母细胞又有几个来源:①直接由卵巢上有腔卵泡抽取或剥离；②由腔前卵泡培养获得；③冷冻保存的卵母细胞。目前广泛使用的是前者，后两者则为卵母细胞提供了更为广阔的来源。

卵巢的采集及卵母细胞的分离

目前动物卵巢主要来自大型屠宰场，采集卵巢前应先将无菌生理盐水加热到稍高于预定温度 (如 38——39℃ )，在出发前倒入预先灭菌的保温瓶中，加人一定浓度的双抗 (青霉素 100U/ml; 链 霉 素 100U/ml)。采集卵巢时要尽量减少对卵巢的污染，动作要快，放入保温瓶前先用温生理盐水冲洗。摘取完卵巢组织后，应用加双抗的生理盐水保存卵巢，实 验 证 明 卵 巢 在 30——38℃ 保 存 4 h 以内最为理想。卵巢的保存温度和时间在不同程度上影响着以后 IVF 〇 W 加 fertilization，试管受精) 的囊胚发育率，卵 巢 在 33〜 3 5 ℃保 存 8 h 以内并不会减弱卵母细胞的体外成熟能力。卵丘卵母细胞复合物 (cumulus oocyte complex,COC) 有剥离法和抽取法两种分离方法。抽取法简便快速，目前应用较多。

带回实验室后，用灭菌温生理盐水或 PBS 冲洗，然后在超净台内分离卵母细胞。用抽取法时，选 择 12 号灭菌针头，抽取前先吸一些卵母细胞洗涤液于注射器中，抽取液注人洁净无菌离心管中。在整个过程中要保温，尽量减小温度变化。卵巢的采集及卵母细胞的分离过程最容易受到污染，所以应尽量保证操作过程中的无菌性。

通过超排卵获取卵细胞

以小鼠为例，细胞核移植受体合子可从杂交小鼠 (C57BL/6xCBA 或 C3 H) 收集，成熟的雌鼠 (6 周) 通过间隔 48 h 注射孕马血清促性腺激素 (pregnant mare serum gonadotropin,P M S G )5U 和人域膜促性腺激素 (human chorionic gonadotrophin, H C G )5U 进行超排卵，
与同品种的雄鼠交配后，收集输卵管。在 注 射 H C G 20〜 22 h 后 ，用 2 7 号针头从切出的输卵管收集合子。将收集到的 C O C 用透明质酸酶 (300N F 单位/m 2) 在 3 7 ℃ 下 处 理 l〜 3 min，使卵与卵丘细胞解离开。用移卵针吸取裸露的 1 细胞卵，并 用 M 2 培 养 基 洗 3 遍 。选取具有两个前核和第二极体的 1 细胞卵用 M 16 培养基在 5 % C O 2 的培养箱中保温。

超排卵注射 H C G 42——44 h 后 ，用 M 2 培养基冲洗输卵管，从雌鼠的输卵管收集 2 细胞期胚胎。 4 细 胞 和 8 细胞胚胎则从体外培养的 2 细胞胚胎收集，后者时在注射 H C G 后65 h 从输卵管和子宫角冲出。紧束化的桑葚期胚胎是通过 8 细胞期胚胎体外培养 24 h 后获得。收集的胚胎温育在 M2 培养基中待用。

卵母细胞的成熟培养

将抽取液倒入平皿中检卵，从卵巢表面 26m m 卵泡内吸取 C O C ，选取卵丘细胞完整、细胞质均匀的 C 0 C ，用平衡好的培养液洗涤几次后，放入成熟培养液中。于 C O 2 培养箱内， 5 % C O 2 浓 度 ， 38.5 丈进行体外成熟培养 18〜 24 h ，检查成熟率。成熟培养液成分为含有 10% F B S 、0.2 mmol/L 丙酮酸钠、0.1m m 〇 l /L 谷氨酰胺、5ug/ml
FSH、 0.3IU/ml L H (黄体生成素)、 1 ug/ m l 雌 二 醇 以 及 25 ug/m l 庆 大 霉 素 的 T C M 199-H C 0 3(含 Earle 氏盐)。培养条件为 38.5℃、 5 % C O 2 相对湿度。

卵丘细胞发散呈放射状是卵母细胞成熟的一个标志，用吸管吹打去卵丘细胞，然后在显微镜下观察极体排出情况。将 成 熟 的 卵 母 细 胞 放 入 0.1% 透明质酸酶的管内振荡2〜 3 min，再用玻璃管轻轻吹打，使卵丘细胞与卵母细胞完全脱离，选择形态完整、细胞质均匀并排出第一极体的卵母细胞为体细胞核受体。

卵母细胞的冷冻与保存

卵母细胞用冷冻保护剂平衡处理，以 l ℃/min的速度降温至-5〜-7℃ ，植 冰 ，然后以l ℃/m i n 的速度降温至-30—40 ℃ ，投入液氮。以 25℃ /m i n 以上的速度解冻，解冻一般在 室 温 或 37℃进行。

受核细胞细胞周期同步化的处理

在 M 期卵母细胞用作受体细胞质时，供体胚胎的细胞周期必须同步在 G1 期 、 G2 期或 M 期 ，因 为 M II 期 卵 母 细 胞 细 胞 质 中 具 有 高 活 性 的 卵 成 熟 促 进 因 子 (maturationpromotion factor， M P F )。当供体细胞与 M I I 期卵母细胞融合时，由于卵质中的 M P F 活性而提早发生染色体浓缩。染色体浓缩过程中卵母细胞内的供体核被激活时，核膜则在细 胞 周 期 的 G1 期初始再度形成，开始形成前核样的结构。如 果 与 M II 期卵母细胞融合的 是 S 期的供体细胞，由于染色体浓缩及其后的激活， D N A 将发生异常。因此，供体细
胞 必 须 处 在 G1 期 、 G2 期 或 M 期 。同 步 到 G1 期 后 ，培养基必须补加芽肠霉素直至与卵母细胞质融合。如果供体细胞处在 G2 期 ，则激活后极体的排除是必需的。

1 ) 4 细胞至桑椹期胚胎

小 鼠 2 细胞期着床前胚胎的细胞周期同步到 M 期的方法已经成熟，并无不良影响。但若需将胚胎细胞周期同步到 4 细胞期时，则 2 细胞期胚胎需在补加诺考达唑 (3ug/ml)的 M 1 6 培养基中温育 I2〜 14 h ，然后用补加芽肠霉素 (5ug g/ml_ M 1 6 培养基来清洗和培养 ，以抑制 D N A 的合成。两个分裂球的分裂都同步发生在撤除诺考达唑后大约 55 min。当桑椹期胚胎需同步在 G 1 期时， 8 细胞期胚胎则用含诺考达唑的 M 1 6 培养基处理 6 h , 然后用补加芽肠霉素的培养基温育。在 4 细胞期的细胞核用作供体时，则用去核针插到每个分裂球的卵周隙来去除核质体。当分裂球小而难于去除核质体时，如在桑椹期胚胎中 ，则除去透明带，在胰蛋白酶-EDTA 溶液中用针将分裂球拆解成单个分裂球。拆解后的分裂球在室温下保持于补加芽肠霉素的培养基中待用。

2) 嚢胚的内细胞团 (inner cell mass， ICM) 和腔壁滋养外胚层细胞
囊胚可从自然交配 4 天后的雌鼠回收或者从桑椹期胚胎培养 24 h 获得。用补加诺考达唑 (3ug/ml) 的 M 16 培养基体外培养 12 h ，囊胚则同步到细胞周期的 M I I 期 。同步到 MII期 后 ，囊胚在不加诺考达唑而补加芽肠霉素 (5ug/ml) 的 M 16 培养基培养 Ih, 以抑制 DNA的合成。除了处于 G 1 期的外，囊胚的透明带均用乙酸 Tyrode 溶液或蛋白酶来去除。

囊 胚 的 ICM 通过免疫外科来分离：在 3 7 ℃下 ，将囊胚用适当浓度的抗小鼠肝脏和肾脏的多克隆抗体处理 3 〇 min。然 后 用 M 2 培养基洗 3 遍 ，再转移到补加补体 (低毒的豚鼠补体) 的培养基 (1:7)37℃ ；下 处 理 30 min。 到这一步，滋养外胚层 (trophectoderm， TE)
破损而分离出 ICM 细胞。

在 制 备 小 鼠 的 T E 细胞时，无 透 明 带 的 G 1 期囊胚则进一步培养在补加芽肠霉素(5 ug/ml) 的 M 1 6 培养基中，直到回收囊胚腔。小 鼠 的 T E 细胞通过免疫外科来仔细分离。分离的 ICM 和小鼠的 T E 细胞用含胰蛋白酶 (0.01%) 和 EDTA(0.02%) 或胶原酶 (200U)和 D N A 酶 (lug/ml) 的 PB S 在 4 ℃ 下 处 理 30 min， 以拆解为单个的细胞。

3 ) 细胞周期的确定

为确定供体分裂球是否处在细胞周期的 G 1 期 ，可以用胸腺嘧啶类似物 5-溴-Z -脱氧嘧啶嘌呤 (BrdU) 掺人法。若 B r d U 掺入到细胞核，则细胞核就已经进入 S 期 。因此，细胞 核 中 B r d U 存在表明细胞是否已停止在 G 1 期 。将可能处于 M 期的胚胎在加有芽肠霉素 (5 ug/ml) 和 B r d U 的 M 1 6 培养基中培养 4 h 。培养末期，胚胎用酸性乙醇固定，在室温下 与 抗 B r d U 的单克隆抗体温育 lh。胚胎经过洗涤后在室温下用过氧化氢酶抗鼠 IgG_2a处 理 30 min，用底物和增强剂处理，在二氨基联苯胺存在下进行观察。作为阳性对照，将可能处在 M 期的胚胎在含 B r d U 而不补加芽肠霉素的培养基中培养。做反染时，用 0.5%伊 红 染 2——3 min。在 S 期 的 B r d U 阳性细胞染成蓝黑色。

去核

卵母细胞去核

卵母细胞成熟后要去掉原有细胞核或使其丧失功能，分去核和灭能两种方法，目前多采用显微去核。成熟卵母细胞去核是核移植技术中的一个重要环节，要求去得干净，又尽可能的减少对细胞质的损伤。卵母细胞去核主要以显微手术操作去核为主。主要包括 ：①盲吸法：用微细玻璃管在第一极体下盲吸，吸出第一极体及处于分裂中期的染色体和周围的部分细胞质。②负压吸取法：在微分干涉差倒置显微镜的高分辨率视野下使卵母细胞轻微旋转，当纺锤体与焦平面垂直时核区与胞质的折光率略有差别，可准确吸出细胞核和少量细胞质，去 核 率 可 达 100%。③挤压法：于近第一极体处的透明带作一切 口 ，用移核管挤压卵母细胞，使第一极体和附近 1/3 的胞质挤出透明带。此法与细胞分裂相有关，必须在恰当的时间进行，否则不能将染色质去干净。④半卵法：切开透明带 ，将一半细胞质吸出并移入另一个空透明带中，在倒置显微镜下用 IOx 目 镜 和 20x 物镜观察裸露的卵母细胞时，可看到含 M II 期染色体的小膨胀区，所收集的 M II 期卵母细胞放在无细胞骨架抑制剂的 3 7 ℃ 的 M2 培养基中，对膨胀区旁透明带进行切割，透明带切割后，卵母细胞在含细胞松弛素 B(5u =g/ml) 的 M2 培养基中温育。细胞松弛素 B 处理后膨胀区就难于辨别。在透明带切割裂缝的对面将卵母细胞持定，将去核针通过裂缝插入到卵周隙。去核针触及卵质时，含 M II 期染色体的半透明区域会随着移动，然后将该区域吸进去核针，同时通过肉眼确定染色质的存在。在将所有的卵母细胞去核后，用 M2
培养基将这些卵洗涤，在室温或 37℃孵育待用。

如果难于找到含 M2 染色体的区域，可 先 用 Hoechst 33342 染色，在进行去核时，可用荧光显微镜观察。具体方法是：将成熟培养 20〜 24 h 的卵母细胞放入含 600IU/m l 透明质酸酶，无 Ca2+、 Mg2+的 M2 液中，用玻璃微针将卵丘细胞吹打干净，选择第一极体已排出的卵母细胞 (MII，中期) 进行去核。卵母细胞用含 0.5|ig/ml DNA 荧光染料 (Hoechst 3342)，7.5ug/m l 细胞松弛素 B 的 无 Ca2+、 Mg2+的 M2 液在室温下染色 15——20 min，然后用不含Hoechst 33342 的 M2 培养基洗 3 遍。在荧光显微镜下用去核针将 M2 染色体除去 (蓝紫，
UV 激发滤光片 400〜 450nm)。 U V 照射的时间对卵母细胞的存活力很关键，不应超过 15s。

此外还有功能性去核，即将受体卵母细胞置于 Hoechest 特异染液中，用紫外线或激光照射，使核丧失功能，但卵母细胞在紫外线照射时间不能超过 30s ，否则其活力将受到严重损害。

合子去核

在显微手术前，将收集的合子在补加有细胞骨架抑制剂 (细胞松弛素 B ，诺考达唑)的 M2 培养基中保温。显微手术时，合子是利用显微操作器和倒置显微镜在操作小室内的一滴扁平的 M2 培养基中操作的。透明带用细玻璃针切割。合子通过持定针对透明带施加负压而持定。然 后 ，将针尖小心向卵周隙推进，使卵质膜不致损伤。将细玻璃针叉住的合子从持定针松开，并在持定针壁反复靠压，直到产生一个切口。透明带切割后，用持定针在透明带切口的对面将合子持定。用去核针或注射针通过切口裂缝插入卵周隙。
再将针尖进 3 两个前核当中的一个附近的一点。将一个前核连带少量的细胞质吸进注射针 ，另一个前核也重复这一步吸出，在这一步，为避免穿透卵质膜，有必要利用细胞骨架抑制剂。合子去核后，再 用 M2 培养基洗，保持在室温下备用。

供 核 细 胞 的 准 备

体 细 胞 作 为 供 核 细 胞

目前已有多种体细胞作为核供体克隆成功的报道，包括羊乳腺上皮细胞、猪卵丘细胞 、牛输卵管上皮细胞、牛耳成纤维细胞等。供体与受体细胞的细胞周期同步化是影响核移植成败的一个重要因素，其中大多数采用 G() 期细胞。获 取 G() 期细胞的方法主要有两 种 ： 一是通过限制细胞培养基中的某种成分，从而使大部分细胞滞留在细胞周期的某一阶段：如用血清浓度递减的饥饿培养法使培养细胞暂时退出增殖周期； wilmut 等就是利用 血清浓度递减的饥饿培养法，即先将乳腺上皮细胞在含 10% 胎牛血清 (FCS) 的培养中培养，然 后 转 入 F C S 含 量 仅 为 0.5% 的培养基中连续培养 5 天 ，从而使培养细胞暂时退出增殖周期。另一种可利用选择细胞类型的方法获得 G0期细胞，如刚排出的卵母细胞其周围的卵丘细胞 9 0 % 以上处于 G0 期。然而近来发现未经休眠诱导的 G 1 或 G 2 甚 至 M期供体细胞的核移植也均获得了成功。

供体细胞的获取：将组织块切碎，并 用 含 0.25% 胰蛋白酶加 0.02% EDTA 的 D-Hank缓 冲 液 在 30T：下 消 化 30 min，中间搅拌几次。用 D-Hank 缓冲液将消化的组织冲洗几次，用 IOOg 离 心 5 min，将上清液用 D-Hank 缓冲液冲洗几次，再将最终获得的上清液700g 离心IOmin 以获得细胞团块。将细胞团块悬浮于添加 10% FC S 的 DMEM 中置于 37℃、5% CO2 的加湿培养箱中进行培养，经 1 〇——14 天后，获得汇合的单层成纤维细胞进行传代，此 后 ，细 胞 每 24 h 传 代 1 次。传代细胞数量足够以后进行冷冻、备用。在进行核移植前3——10 天 ，将成纤维细胞放入含 0.5% 血 清 的 TCM199 中进行血清饥饿法培养，以使其退
出 细 胞 周 期 并 进 入 G0/G1期 。用 0.25% 胰蛋白酶加 0.02% EDTA 将培养皿中的细胞进行短时间消化，再 用 TCM199 洗 净 ，放入操作液中。

胚 胎 干 细 胞 作 为 供 核 细 胞

胚胎干细胞 (embryonic stem， ES) 是早期胚胎细胞或囊胚 I C M 细胞经抑制分化后培养而筛选出来的一类全能性细胞，这种细胞具有正常的二倍体核型，它既可以在特定条件下进行无限增殖而不发生分化，又可以在特定条件下分化为包括生殖系在内的各种细胞和组织。 E S 细胞具有体外发育的全能性，并且可以在体外无限传代，因此，它是动物克隆的理想供体细胞。迄今为止，已经建立了小鼠和人的 E S 细胞系，利 用 E S 细胞进行
核移植的主要研究方向是利用这些细胞生产转基因动物，E S 细胞作为核移植供体细胞制备方法与体细胞的制备方法类似，也需进行细胞周期的调控。

从卵裂球中获取 E S 细胞的过程：先用胰蛋白酶消化卵裂球外面的黏蛋白层和透明带 ，再把胚胎放在含 0.25% 胰蛋白酶的 PBS 缓冲液中消化，用细玻璃管吹打，使细胞分散开。若要得到单个细胞，先把组织切成碎片，用 含 0.25% 胰蛋白酶加 0.02% EDTA 的PBS 缓 冲 液 在 3 0 ℃下 消 化 30 min，并不时加以搅拌，在 IOOg 离心消化液 5 min 取上清，
在 700 g 离心 上 清 IOmin, 获得粒状沉淀，用 a-M E M +10% FCS 稀释沉淀，在 37℃ 、5% CO2下培养，备用。

胚胎干细胞维持的基本操作流程：
E S 细胞由四孔板传至 3 5 mm培养皿后，记 为 〇 代 。一 般 E S 细 胞 每 2〜 3 天 以 1 : 3比例传代一次。培 养 E S 细胞的培养皿在接种饲养层细胞前最好用 0.1% 明胶处理。

⑴ 去 原 培 养 基 ，加 入 1.5 ml PBS 洗 1 次 。

(2) 加 人 1.5 ml 0 . 2 5 % 胰蛋白酶-EDTA 溶 液 ，消 化 5m i n 后 ，加 入 含 1 5 % 胎牛血清的DMEM 高糖培养基中和胰蛋白酶。

(3) 吸管轻轻吹打，直至成为单细胞悬液。

(4) 细胞悬液按 1 : 3 的比例转移到新的含有饲养层的 35m m 细胞培养皿中，补加一些相同的培养基。

(5) 将细胞悬液摇勻后，置 入 3 7 ℃ 、 5% CO2 培养箱中培养。

(6) 每日换液一次，若细胞长满可传代。

扼要地说，即是将 E S 细胞与事先用丝裂霉素 C (l 0ug/ml) 灭活的小鼠原代培养的胚胎成纤维细胞共培养。 E S 细胞目前还很难同步到 G 0 期 和 G1期 。可以将 E S 细胞的细胞周期按 E S 细胞的大小来区分， M 期 E S 细胞呈圆形，易于区别。在 用 M 期 的 E S 细胞为供体
细胞时，核移植后的卵母细胞发育至囊胚比例高，就同步到 M 期 的 E S 细胞来说，在作为细胞核移植供体用之前，细 胞 培 养 要 在 含 诺 考 达 唑 的 培 养 基 中 培 养 3 h 后再用。

核 移 植

受体细胞和供核细胞准备好后，在显微操作仪的帮助下，就可以将分离的完整供体核移入受体细胞中。根据供体核移入到受体细胞不同部位，可分为带下注射和细胞质内注射，通常的核移植程序中，应用的卵母细胞外面包被透明带，但也有些学者采用无透明带的核移植方法。无透明带的核移植方法一般包括：①将卵母细胞切成两半；②在紫外光照射下选择无染色质的半卵，将包含母源染色体的一半胞质体丢弃；③将一个体细胞核与两个半卵融合；④单个核移植胚胎的体外培养。这种方法产生的核移植囊胚与具有透明带的核移植囊胚有同等的质量，也验证了一个被早期研究证实的观点：透明带对于胚胎的体外发育不是必需的。但这种半卵法有其缺陷，其一是浪费了 5 0 % 的卵母细胞胞质，其二是将三种不同的线粒体置于一个细胞内，增加了线粒体异质体的发生率。

将洗净的卵母细胞或从 M16⁺ ET 培养液中取出的卵母细胞置于位于操作小室底部约2 0 ul的 3SCOM 操作液中，室温预处理 5——10 min。操作小室由载玻片和有机玻璃制成。在倒置普通光镜下观察，可见到卵细胞边缘有突起 (突起部位下方为 M2 期核或纺锤体)。在此区上方用玻璃微针将透明带切开 1/4-1/5 的周长。用 外 径 22pm、内 径 20u m 的注射针从切口处吸出包含少部分细胞质的 M2 期核 (纺锤体)。在注射管中看到纺锤体与其他部位胞质明显不同，吸出的核质体中纺锤体也明显可辨。用注射针将吸出的 M2 期核 (纺锤体) 经透明带切口插入经去核操作的卵母细胞的透明带下，推出分离的纺锤体。完成大约 1 5 个重构卵后即进行下一步的电融合。显 微 操 作 在 22〜24℃：的室温中进行，大约
45 min。一部分卵母细胞在含 5〜 10ug/ml 浓 度 的 Hoechst 33342 的 无 C B 操作液中处理lOmin，然后在紫外线 (UV) 下观察，检 验 3SCOM 操作液处理的显示及去核效果。

核移植中尽管广泛地应用了人工激活的卵母细胞，但是由于缺乏诸如受精这些自然过 程 ，受精卵的胞质环境仍然被认为优于卵母细胞，连续核移植就是为了弥补这一缺陷。它包括两个步骤：第一步是将 M II 期的卵母细胞与供核细胞融合，第二步是将其形成的原核移入到去核后的原核期的胚胎。后者的目的是使克隆胚体细胞来源的原核进入自然受精的原核阶段的胞质。

融 合 与 激 活

融合
由于移植过程中不可避免的机械损伤，因此必须在核移植后进行进一步融合处理，使重构胚融合，提高成活率。目前常用的是电融合法，其融合率较高。电融合是指把供、受体细胞放于有电融合液的电融合槽中，用电脉冲使两者胞膜穿孔而融合的过程。进行电融合处理时，要将待融合的供、受体之间的接触面与两个电极平行，要根据动物品种、供体细胞的直径和卵母细胞的成熟时间的不同来选择相应的电融合参数，直径越小，成熟时间越长，所需的电脉冲强度越大，融合时间越长。

重构卵母细胞经 3 次 M 2 培养基洗净后，直接放入电融合液进行电融合或在 C 〇 2 箱中培养 3 0 m i n 后进行电融合。此时 为 H C G 注 射 后 的 16——18 h 。电融合采用平行不锈钢丝小 室 ，电极直径〇.3m m ，距 离 0.6m m 。电融合液为〇.3mol/L 甘露醇，含 O.lmmol/L MgCl2、0.05 mmoI/L C a C l 2、 0.05% 的 B S A 和 0.5 mmol/L H E P E S 。重构卵在 37T ；预温的电融合液中 平 衡 3m i n 后移入两电极间，用手拨动使供体核与受体的接触面与电极丝平行。采用160〜 170V /m m ， 20|is，间 隔 Is 的 2 个脉冲进行电融合。融合后的卵母细胞经 M 2 — 培养基洗 涤 3 次后移入 M 16+ E T 培养液中， 30m i n 后观察，未融合的重构卵母细胞再进行第二次 、第三次电融合。

调节待融合细胞在电场中排列方式有两种：一是采用交流电压形成的电场；二是采用手动方式。融合脉冲为直流电矩形波。不同动物间、不同融合条件下，要对电融合适宜参数做适当改动，对于较小的细胞与去核卵母细胞融合所需要的电脉冲强度，要高于较大的细胞融合所需要脉冲强度。而较高电脉冲强度对于大的去核卵母细胞作用太强，易导致裂解，因而对这些因素必须综合考虑。 目前一般采用交流电场排列细胞的方向即交流定位，常用的频率为 6 0 0 〜 IOOOkHz, 电压为 5〜 6 V ， 持 续 时 间 5 —— 1 0 s。 常用的直流电融合条件为 1 . 0 —— 2 . 0 k V / c m 的场强， 3 0 〜 6 0 us的持续时间。目前报道体细胞核移植研究中，多采用相对较高场强 ( 2 k V / c m ) 和短脉冲 (10〜 3 0 us进行融合。

融合方法还可以通过化学试剂 (如乙醇、钙离子载体、锶等) 处理以提高核移植的效 率 。

激活

核移植中，因缺乏精子介导的受精，为了使克隆胚胎进一步发育，卵母细胞的人工激活是非常必要的。各种激活方法都是为了创造一个短暂的 Ca2+的波动，作用 于 Ca2+信号途径下游通路能导致卵母细胞激活。但这个过程往往难以完全复制自然的过程，而只是导致细胞内 Ca2+—过性升高。卵母细胞的激活对于克隆胚后续的发育有长久的作用。

电脉冲激活法：将重构的卵母细胞转移到载玻片上存有的 Zhnmermann 细胞融合培养基的两根距离 I m m 电极丝的小室中。对重构的卵母细胞相隔 20m i n 施予的两个 50 us的 50V /m m 电流 (D C ) 脉冲。若供体细胞不融合，则先给予 A C 脉冲 (100〜 150kHz,5V /m m )，再 施 予 D C 脉 冲 ，或者人工而不是 A C 为供体细胞确定位置，使之平行于电极丝和受体卵母细胞之后，再 施 予 D C 脉冲。重构卵母细胞经过电脉冲后，在 M1 6 培养基中培养5 h ，并查验在卵质中供体细胞核衍生的前核样结构的形成。

另外其他的化学试剂，如乙醇、 Ca2+载体、 SrCl2、放线菌酮、离子霉素等也能使卵母细胞激活。重构的卵母细胞培养于补加 7 % 乙 醇 的 M 1 6 培养基中作用 7m i n 即可被激活 ，并形成原核，而且重组胚发育至囊胚时，细胞数目多，囊胚质量好。

重构胚的培养及观察

重 构 胚 的 培 养
激活后，将重构的卵母细胞培养于 M 1 6 培 养 基 中 15〜 6 0m in， 并对融合进行核查，融合的卵在体外培养 4 天 ，发育为囊胚期的胚胎，再移植入雌性受体体内，通过输卵管移植是在 0.5 天 ，子宫角移植则在 3.0〜 3.5 天。

哺乳动物的重构胚的培养有两种：①体外培养，即在适当的条件下培养到胚胎植人前 的 某 个 时 期 ，然后进行胚胎移植 (将复合活性化处理的移核重构胚洗涤 2 次 ，采用CR2aa+ 1 0 % FCS+10jilInsulin+100IU/m l 青霉素+ l 〇〇 mg/L 链霉素培养液进行发育培养，168 h 后观察移核重构胚的囊胚发育情况)；②采用中间受体培养，在核质融合后，将重构胚移入暂时的同种或异种受体动物的输卵管或子宫，几天后收集桑椹胚或囊胚进行形态学检测后，再重新移入假孕体子宫发育直到动物出生；或在囊胚形成后，再在定向诱导下向组织器官发育，最终应用于临床移植。

体外培养哺乳动物胚胎的主要障碍是发育阻滞，但不同的动物出现在不同的时期。研究表明，胚胎发育阻滞与基因组激活关系密切，多发生在胚胎卵源性基因调控向胚源性基因调控转化，即胚源性基因激活时期，因此推测发育阻滞可能与胚源性基因激活不全或激活失败有关。体细胞共培养系统能在一定程度上克服胚胎发育阻滞，其原因可能在于体细胞能产生促有丝分裂因子和细胞外基质成分，促进胚胎细胞分化，并可代谢或除去培养液中的胚胎毒性因子。

不同类型的体细胞的共培养效果是不一样的，一般采用输卵管上皮细胞和颗粒细胞。在进行兔的核移植研究时发现，在基础培养液相同的条件下，与胎儿成纤维细胞饲养层共培养，尤其是与同源胎儿成纤维细胞饲养层共培养，有利于重构胚的发育，尤其是有利于提高桑椹胚和囊胚的发育率。培养液主要有 TCM-199 和 C R laa 等 ，在基础液的基础上再加其他因子。

重 构 胚 的 体 外 培 养 观 察

激活后，核移植体再次洗净并放入 SOFaa 中培养，培 养 24 h 后观察初始卵裂情况，并在随后的 7 天里每隔 2 处观察一次发育情况。在胚胎发育的不同阶段，随机取出几枚重构胚胎用 Hoechst 33342(5ug/ml) 染色以确认在每个胚胎的卵裂球中都有核，从而证明确实是移入的核进行了分裂而不是由于细胞质碎裂造成卵裂率偏高的假象。

数 据 处 理

所有数据都用 X² 统计法进行分析，凡 是 p <0.05 都认为是差异显著。