丁香实验_LOGO
登录
搜索
    搜索
    提问
    我要登录
    ｜免费注册
    点赞
    收藏
    wx-share
    分享

    抗 体 的 化 学 和 蛋 白 水 解 修 饰

    相关实验：抗体的化学和蛋白水解修饰实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

    9. 2 —^ 般步骤 9 . 2 . 1 抗体溶液的稳定性 IgG 是最稳定的球蛋白之一，通 常 在 PH5〜9 、不 高于 20mg/m l的缓冲液中均为可溶 且 稳 定 的 。缓 冲 盐 是 最 常 见 的 储 存 缓 冲 液 ，含 有 约 〇. 15mol/L NaCU浓 度 为 5〜lOOmmol/L ，具 有 适 宜 缓 冲 pH。本 章 许 多 流 程 应 用 了 弱 磷 酸 盐 缓 冲 液 （ LoPBS; 0. 15mol/L NaCl, 5mmol/L NaH2PO4，用 NaOH 将 pH 调整至 7. 0)，强磷酸盐缓冲液 (PBS; 0 •15mol/L NaCU 0. lm ol/L NaH2PO4，用 NaOH 将 pH 调节至 7. 2)或者强 Tris 盐缓冲液（ TBS; 0. 15mol/L NaCl， 50mmol/L Tris •HC1， pH 7. 5)。弱缓冲液的优点 是可通过添加高浓度的另一缓冲液而随时调整所需的pH。抗 体 溶 液 可 于 4°C 条件下储 存数月乃至数年，尤其是加有抗菌防腐剂[通常为〇 .〇 5%NaN3 ; 其毒性近似于氰化物， 虽然不易挥发，但高浓度储存液(如5 % ) 应用时需十分谨慎]时。 IgG 溶液常能耐受反复 冻融而损失较小，因此可储存于一 20°C 或一 80°C 条件下 。 一 种减少冻融损耗的储存方法 曰趋受到推崇，将抗体溶液与等量超纯甘油混合后储存于一20°C ，在此温度下，5 0 % 的甘 油并不冻结。高浓度甘油可以降低溶液pH ，因此抗体溶液应在加入甘油之前配制所需 P H 的强缓冲液。 少量抗体可因吸附于容器表面而损失，聚苯乙烯和玻璃制品对蛋白质的吸附性尤其 强 ，当然聚丙烯和其他表面也可发生微量吸附。不 过 ，当 Ig G 溶液的浓度低至I fXgAnl或 以下时，仍可放于聚丙烯实验器具内。但 是 ，更为可行的方法是将稀释的抗体溶液（ < 50/xg/m l)加入保护性纯化的非干扰性携带蛋白质，如牛血清蛋白（ BSA) ，使其浓度达到 l 〇〇/xg/m l 或更高。 多数抗体可长期冻干储存而几乎不影响活性。为了实现这一目的，可采用后文提到 的缓冲液交换方法之一，首先将溶剂变为水或弱挥发性缓冲液，如 10mm〇l / L 重碳酸铵或 乙酸铵，而后溶液在冻干瓶中被贴壁冰冻进而冻干。为去除所有的挥发性盐，绒毛状的白 色粉末可于纯水中再次溶解、冻干。最后无盐粉末以干粉状储存于暗处可达数十年，并且 当需要时可溶于所需缓冲液中至所需的浓度。另外一种简单的替代方法就是将抗体直接 冻干于非易挥发性缓冲液中，从而省去缓冲液交换步骤；在此情况下，需要注意当盐浓度
    不断升高时，应具备足够的真空度以保证溶液的冻结状态。用这种方法冻干的抗体当再 次使用时，应溶于适量水中从而达到所需的缓冲液浓度。 9 . 2 . 2 抗体的定量 表 9. 2 列出了 IgG 定量最常用的三种方法，其中第二列和第三列显示了该方法所能 测 得 的 IgG 极限量和最小浓度值。但这些方 法 并 不 能 将igG 与其他蛋 白 质 区 分 开 ，因 此 ，只能用来测定以IgG 为主要成分的蛋白质溶液。三种方法各有其适用性、优缺点，下 面将逐一进彳了讨论。 表 9 . 2 抗体定量方法总结 方法 最小量/^tg 最小浓度/(pg/ml) 主要干扰物 备 注 分光光度法 2① 20 许多紫外吸收污染物 278nm 时 lmg/m l溶 液 的 吸 光 度 值 为 1. 4 Bradford 法 1. 5 60② 去污剂 包括源于同一物种溶于相同缓冲 液 的 IgG标准品 BCA法 1. 3 10 还原剂；许多其他有机化 合物，如 Tris 包 括 溶 于 相 同 缓 冲 液 的 IgG标准 品 ，适合于磷酸盐缓冲液 ①假定 微 量 比 色 杯 具 有IOOyl的容量；②如用自制的浓缩染液，蛋白质量可减少到约l ( Vg/ml。 9. 2. 2. 1 分光光度法（ scanning spectrophotometry) 图 9. 1 显示了溶于P B S 的 IgG 溶液其紫外吸收谱，PB S缓冲液作为空白对照。实际 上 ，对于任何近于中性的缓冲液都可得到同样谱形。鉴于多数大型蛋白质含有色氨酸和 酪氨酸（ 主要的紫外发色基团），其 吸 收 峰 在 278nm，传 统 上 蛋 白 质 的 吸 收 峰 为 280nm。 如 图 9. 1 中所示纯化的非聚结态IgG 溶 液 在 320nm 波长处的吸光率极低，但如果出现大 量的聚结或存在不溶物质时，则在该波长可发生显著的光散射。由于光散射受波长的影 响相对较弱（ 在极少量聚结时的R a y le ig h 散射仅与其四次幕逆相关），因此可用基本上不 出现光波吸收的320nm 光密 度 ，粗 略 估 计 278n m 的光散射情况。两者的差值可以测算 出 278nm 真正的吸光率。图 9. 1 中的实例，校正光散射后278n m 波长的实际吸光率应为 0.371 S ---------------------- --- ^ \ • 138 • 图 9. 1 典型的IgG紫外吸收光谱
    0.371 —0.002 = 0 . % 9 (通常光散射校正值比这一例子要大得多）。 Mandy和 Nisonoff 测 得 Img/m l兔 IgG 溶液的吸光率为1.4,这一系数通常可用来对各种来源IgG 溶液的 浓度进行换算。如 图 9 . 1 中 IgG 溶液的浓度可以这样计算：0.369/1. 4 = 0.264 mg/ml， 若分子质量为150kDa，则相 当 于l .76^mol/L 。紫外吸收污染物经常会使短波长的光谱 发生改变，只 要 278nm 附近有可辨识的隆起或缓峰，且在峰值后的下降趋势随着波长增 加有所呈现，则可以将278nm 的吸光率作为测定蛋白质浓度的可靠指标。如 果 确 认 IgG 溶液未受紫外吸收污染物和光散射聚集物的影响，则 275〜280n m 的单 一 吸光率可用于 测 定 ，而不必进行波长扫描。 9. 2. 2. 2 B ra d fo rd 法 该颜色测定方法的原理为：考马斯染色液在酸性溶液中与蛋白质结合，使其最大吸收 峰位置由470nm 变 为 595nm。典型的测定方法是:将25(^1商品化的稳定的酸性染料溶 液（ 如考马斯蛋白测定试剂， Pierce Chemical Co.， Rockford, IL)分别与待测的未知IgG 浓度的样本溶液5〜25W 及 已 知 IgG 含 量 为 0 •625〜7. 5Mg 的标准品（ 相同缓冲液）相混 合 。经过至少10〜15m in的平衡期使染料与蛋白质充分结合，然后可通过分光光度计或 读板机测定595nm 的吸光度值,前者最好应用一次性塑料杯以免染料污染玻璃和石英表 面。图 9. 2 显示了 IgG 标准 品PBS溶 液 的 Bradford法 4 次重复测定结果。数据通过最 小二乘法处理得到经验的曲线公式，以这种简洁实用的计算方式获取标准品的信息，通过 公式的反转变形可以计算未知样本平行测定的光密度值推算出其IgG 浓度。 图 9. 2 Bradford法应用光密度值测定IgG含量。观察数据与理论曲线^ = 6 + 1 十 C々/c ) 吻合，式中◊ 为光密度值K 为 Ig G 含量;6、OT 、々和„ 为校正后的参数。 一般而言，Bradford法兼容于多种溶质和杂质，包括几乎所有常用的缓冲液成分，但 其对去污剂却异常敏感。不同的标准蛋白，即使是来源于不同物种的IgG ，取决于氨基酸 成分和其他特性可形成完全不同的标准曲线。例 如 ，兔 I g G 的吸光度值约为相同浓度人 或 牛 IgG 吸光度值的一半
    9. 2. 2. 3 B C A (b ic in c h o n in ic acid)法 这种比色法的原理是检测蛋白质的酰胺键和某些侧链将Cu2+ 还 原 生 成 的 Cu+ ，Cu+ 与 B C A 形成螯合物，其 在 562n m 处吸光度最强。常规方法是将样品和I gG 标准品分别 溶于同种缓冲液，如 P B S 中，各 取 128^1滴 人 9 6 孔酶标板或微试管，同时在单独的容器中 取适量商品化试剂盒中的组分混匀配制B C A 工作液。例如，对 于 一 个 9 6 孔酶标板而言， 使 用 Pierce公司的微量B C A 蛋白定量检测试剂盒时，需 将 7. 5m l试 剂 M A 、7. 2m l试剂 M B 以及300ju l试 剂 M C 混合。每个标准品和样本孔均加入128jlJ 工作液，待测板或小管 经 37°C 孵 育 I h 使充分进行显色反应。冷却至室温后，562n m 的光密度值可通过酶标仪 或分光光度计测量，后 者 最 好 使 用 一 次 性 塑料比色杯以免染料污染玻璃和石英表面。 图 9. 3显示了一系列Ig G 标准品的测量结果，在测定范围内光密度值随着IgG 浓度呈线 性增加。 图 9. 3 BCA法由光密度值测定IgG含量。连续的直线为数据（ 菱形）的最佳线性拟合。 B C A 法 同 B ra d fo rd法相比，其对去污剂的敏感性较低，但却与许多缓冲液不相容，如 浓度很低的 T r i s 溶液。巯基乙醇(9. 4. 2 节）等硫醇也具有干扰性，但 P ie r c e 公司提供的 试剂盒可在加入工作液之前通过碘乙酰胺烷化作用来中和硫醇。由 于 B C A 法对许多溶 质敏感，因此强烈建议使用完全相同的缓冲液溶解或稀释I g G 标准品及未知I g G 样本。 因 B C A 法主要的蛋白质反应剂是酰胺键，适用于所有的多肽，因而标准曲线中蛋白 质-蛋白质的变异远远小于B r a d fo r d 法或分光光度法。因而，B C A 法尤其适合于测定复 杂样本中的总蛋白质浓度，如含有成百上千不同种蛋白质的天然液体或组织提取物。 9. 2. 3 抗 体 的 浓 缩 和 缓 冲 液 置 换 多种离心浓缩装置可通过商业途径购买。相对低浓度的抗体溶液受力于离心作用通 过超滤膜，小分子溶质得以透过而抗体和其他大于一定尺寸（ 如 30kDa)的蛋白质得到保 留。因此蛋白质被保留在容量逐渐缩小的所谓“渗余物”溶液中，而小的溶质与水一起通 过滤膜进人滤过小室。表 9 . 3 列出了一些装置，给出了各自的容量（ 起始溶液的最大体 积）和大约的终末体积（ 最大浓缩后残留渗余物的体积）；这些体积的不同通常取决于这些
    装置是在平转斗（90°)还是固定角转头中进行离心。容量除以终末体积为可得到的浓缩 倍 数 。某些情况下，按照这些浓缩因子制备成最大浓缩后的起始抗体溶液会形成黏性的 胶 体 ，非常难以稀释成均一的溶液。因此，最好将浓缩率限制在使得抗体最大浓度不超过 20mg/m l。这是一个烦人的过程，需反复停止和重新离心以不断监控浓缩过程。为了避 免这种不便，一 些 装 置 已 经 适 度限制了最大浓缩率，使 用 户 不 致 过 量 浓 缩 抗 体 。尽管 P ie r c e公 司 的 iCON 7m l和 iCON 20m l具有最高的浓缩率，但获得所有增加的终末体积 可以通过向滤过小室内添加缓冲液，最终滤出液增加所产生的反向流体静水压会逐渐与渗 余物水平下降所致的正向流体静水压相等，从而使过滤过程停止。 P ierce的说明书给出了 在不同旋转角度下得到各种终末体积所需的总容积(起始量加上额外的滤出液）。 溶 解 于 一 种 缓 冲 液 中 的 抗 体 可 通 过 传 统 的 透 析 管 或 透 析 卡 （ 如 P ie r c e 公 司 的 SlideA -L y z e r s 透 析 卡 可 通 过 注 射 器 注 入 0. 5m l、3m l、12m l 或 20m l 样 品 ）利 用 另 ~ 种 缓 冲 液 进 行 透 析 。 为 了 减 少 相 对 损 失 （ 如 Slide-A -L y z e r s 中 的 注 射 器 、针 头 或 透 析 卡 本 身 ），最好选 择 与 所 要 透 析 量 相 一 致 的 容 量 类 型 。对 于 少 量 样 品 而 言 ，应 用 适 当 容 量 的 离心浓缩 装 置 反 复 浓 缩 和 再 稀 释 来 置 换 缓 冲 液 更 为 方 便 。 表 9 . 3 离 心 浓 缩 设 备 总 结 装 置 供 应 商 转 孔 尺 寸 / m l 角 度 / o 容 量 终 含 量 C e n tric o n P lu s -8 0 M illip o re 250 90 8 0 m l 300/liI J u m b o s e p P a ll 250 90 6 0 m l 3. 5 〜 4 m l C e n tric o n P lu s -2 0 M illip o re 50 90 2 0 m l 200^1 iC O N 20 m l P ie rc e 50 90 2 0 m l 20^1 23 〜 45 13. 5 m l 65^1 90 1 5 m l 〇 • 5 〜 I m l M a c ro s e p P a ll 50 45 15m l I 〜 I . 5m l 34 12. 5m l I ' I . 5m l 23 9m l I. 5 〜 2m l C e n trip re p M illip o re 250 90 1 5m l 3 m l 22 1 2m l 2. 5 m l U l t r a - 15 M illip o re 15 90 1 5m l 50^1 35 1 2m l SOjLtl C e n trip lu s M illip o re 50 90 15m l 500^1 25 IO m l 500^1 iC O N 7 -m l P ie rc e 15 90 7 m l 10/Ltl 23 〜 45 4. 5m l IOfil U ltra -4 M illip o re 15 45 〜 90 4 m l 20^1 23 3. 5 m l 20^1 M ic ro se p P a ll 15 45 3. 5m l 30 〜 40 34 3. 5m l 40 〜 50fxl C e n tric o n M illip o re 15 23 〜 45 2 m l 40^1 M icro co n M illip o re M ic ro c e n trifu g e 固 定 500/nl 5 〜 15 卩1 N a n o se p P a ll M ic ro c e n trifu g e 固 定 500^1 15^1
    无论是透析管、透析卡还是离心浓缩装置,透膜的选择均很重要。膜的截留分子质量 (能够通过膜孔的最大分子的额定分子质量）应该低于所要浓缩的蛋白质分子质量（ 完整 IgG 为 150kDa，F a b 片段为50kDa)。透膜非特异性吸附蛋白质的容量要低，而且对于抗 体溶液中所有的溶质均有较好的抵御性(包括前述的污染物）。最常见的膜材料是具备这 些特性的再生纤维素。 当缓冲液置换必须快速完成时，如 在 IgG 加合物非常不稳定的情况下，脱盐凝胶柱 过滤与透析方法和离心浓缩装置相比则成为首选，因 其 可 在 1〜 15m in内完成。在这 一 过 程 中 IgG 可 被 稀 释 2 倍 甚 至 更 多 。许多厂商可提供各种容量的预制重力柱与离 心柱。 9. 3 胺类的修饰 9. 3.1 总体考虑 典型 的IgG 分子天然状态下约有3 0 个暴露于表面的cr氨基组和e-氨基组；其未质子 化(非电离）形式是强亲核试剂，可以在温和的非变性情况下被许多试剂有效地修饰。在 小型非结构模式化合物中，e-氨基典型PKa 约 为 9. 5,因此 在 pH7. 5 时 仅 约 有 1 % 未质子 化的形式。无论如何,IgG 和其他天然蛋白质中许多暴露的e-氨 基 组 在 p H 接近中性时 易于与胺反应性试剂相互作用。半胱氨酸的自由硫醇(非二硫键的）和酪氨酸的酚羟基未 质子化(负电荷)形式也能与胺反应试剂作用，生成的加合物有时足够稳定而在功能上与 胺加合物区别不大。其他羟基的亲核性通常比巯基和胺低得多，但 Ig G 的自由巯基是很 少见的（ 图 9. 14)。在本章中，当基团可以被这类试剂稳定修饰时即被认为是“胺”，即便 偶尔也会包括巯基或酚羟基。 尽管一些可修饰性胺位于或靠近抗原结合位点，但更多的则位于分子表面的其他部 位 。这些基团部分被小分子附加物随机修饰，除了极少的一部分 ，一 般 不 会 造 成 Ig G 的 功能失活，因此胺修饰已成为将生物素、荧光染料和其他附加物偶合到抗体上以及将抗体 偶合到固相亲和介质上的最常用方法。控制修饰的水平是这项技术成功的关键:修饰不 足则不能使IgG 获得所需的特性，而过度修饰则会大大损害抗原结合功能。因而，为了 设计有效的反应流程，必须对修饰的动力学有一些基本了解。 图 9. 4 上部分显示为一般的胺修饰反应，其中蛋白氨基基团对试剂的亲电子中心进 行亲核攻击，导致氨基基团与偶合基团R 相 接 合 ，R 可为整个试剂或其中一部分。由于 周围是水相，修饰反应难免会不同程度上受到试剂水解失活作用的牵制，如 图 9. 4 下部分
    所 示 ；所以胺反应试剂长期储存时必须保持干燥，通常放于干燥器中。显然反应的适宜条 件应该尽可能排除水以外的任何亲核试剂的竞争，包括硫醇，如 2-巯基乙醇（2-ME)或二 硫苏糖醇（ DTT) 级胺，如 Tris基 ；以及二级胺，如 Bis-Tris-丙烷 等 。针对水和其他亲 核试剂对胺试剂的选择不仅依赖于亲电子中心的亲电子性，还受其他因素的控制，如周围 原子的空间位阻或这些原子参与配位键重排的有效性。 水解可以分为两种方式:一种为非蛋白质依赖性，其 水 解 速 率 不 依 赖 于IgG 浓 度 ；另 一种为蛋白质依赖性，其水解速率随IgG 浓度成比例变化。蛋白质依赖性水解可能包括 无效修饰(如组氨酸），形成的加合物立即水解恢复为最初的蛋白质基团。两种类型水解 的速率均与温度、p H 和缓冲液的构成有关。 基于上述考虑，借助于简化的假设，作者建立了一个数学模式用以较为精确地描述当 初始的全部试剂均被水解和修饰所消耗时，反应完成后所能达到的修饰程度，此时[33]: R = (9. 1) 式 中 ，P 为 Ig G 浓度（ ym ol/L ) ，M 为 每 个 Ig G 分子可修饰胺的总数目（ 无量纲），m 为修 饰水平(每个Ig G 分子被修饰的胺的数目）（ 无量纲），!？为达到最终修饰水平w 所需的最 初试剂浓度（ Mmol/L ) ，々 m 为二级修饰速率常数[ " ( m o l/L • s)]，々h 为一级蛋白非依赖水 解速率常数(S”），Q 为二级蛋白依赖水解速率常数[； V (m〇l/ L • s)]。 公式含有三个动力学参数M j hA m 和 Q A m,它们的数值并不是由模式本身推算指 定 的 ，而是根据经验由不同试剂和一系列反应条件（ PH 、缓冲液构成和温度）所决定的。 数值可通过测定达到试剂浓度尺和Ig G 浓 度 P 范围内的修饰水平m 来估算。参数值确 定 后 ，应用式（9.1)带来了巨大的使用便利：它可以告诉实验者，当已知欲修饰的Ig G 浓 度 为 P 时 ，若想达到所要的修饰水平m ，需多大的试剂浓度及。 式（9. 1)的定量应用将以下面实例说明（9. 3. 3)，同时还要强调作为成功应用关键的 定性原则也很重要。根据该公式，达到固定修饰水平m 所需的试剂浓度尺随着Ig G 浓度 P 呈线性增加，斜 率 为 [m —f l n 〔 l 一益)卜截距为一 |Mn〔l —益 ) （ 由于对数为负值， 所以两者总为正值）。考虑到两种极端情况，一方面，由于蛋白质浓度P 很高或非蛋白依 赖的水解速率与修饰速率的比值很低（ 如紅/L 值相对低），可忽略截距项，则达到给定修 饰 水 平 m 所需的试剂浓度P 直 接 与 IgG 浓 度 P 成正比。此 时 ，m 仅对其比值尺/P 的改 变敏感，而非单独的尺值或P 值变化。另一方面，如果截距项占优势DP值相对低和（ 或） 是 h/々 m值相对高]，则达到给定修饰水平m 所需的试剂浓度不依赖于蛋白质浓度。此 时 ， IgG 达到特定的修饰水平，不 必 知 道 IgG 浓 度 P 的确切值。在这两种极端情况之间，修 饰 水 平 m 既依赖于试剂浓度尺，也 依 赖 于 IgG 浓 度 P ，不仅仅是两者比值也不仅仅是单 独 的 i? 值 。遗憾的是，文献和厂商目录中充斥着许多误导性的描述和建议，即使当比值 已经明显不能完全确定反应情况时，无经验的用户依然被导向仅关注i V P 值 。 当仅有相对较小的一部分胺被修饰，即 m/M < 4 0 % ，则 式 （9. 1 ) 的对数项约等于 一m/M ，公式可以简化整理为另一种近似形式
    因此这些情况几乎涵盖了本章所要讨论的所有胺修饰反应，当给定蛋白质浓度p 后 反应完成时所达到的修饰水平m 几乎与试剂浓度与蛋白质浓度之比尺A P 成正 比 ，公式 右侧的第一部分为比例常数。同等情况下，控制反应动力学的动力学参数量由三个缩减 为两个:Q/M々 m和 ^ /JVf^ 。在式（9.1)中全部三个参数模式的对数据拟合以确定最佳动 力学参数时，则拟合过程对M 、Q/々 m和魟A m各自的数值不太敏感，而 对 Q/M々 m和 紅 / M々 m的商更加敏感。同理，由这种方式决定的最适值M ，Q A m 和 不 能 不 加 鉴 别 地 表示其名义上所测量的物理学参数。 9 . 3 . 2 胺 反 应 试 剂 的 分 类 图 9. 5 列举了通常用于修饰IgG 的商品化胺反应基团分类。每一类中，形形色色偶 联 在 Ig G 的 R 基 团 （ 表 9. 1 中列举的附加物之一）各 不 相 同 ，在 图 9.5 中并未加详细
    最常见的一类胺反应化合物是酰化试剂，羰基通过连接到解离基团而被激活。其中 最主要的是AT-轻基號拍酰亚胺醋（ N-hydroxysuccinimide esters，NHS) ，此 外 ，图中还包 括一类具有更为活跃的五氟苯酚解离基团的新型试剂以及另一类在蛋白质化学中经久不 衰的酸酐。图示的酸酐具有对称的,同R 基 团 ，但有时也用不对称性酐；而环酐的单一 分子结构则连接着两个羰基(如马来酸酐或丁二酸酐）。这些试剂具体的酰化作用不同， 取决于解离基团的性质，但其胺的修饰产物则是相同的：极稳定的酰胺基连接在R 与蛋 白质之间。巯基的酰化作用（ 如果存在的话—Ig G 中的自由巯基是很罕见的）生成硫 酯 ，后者在缺乏亲核试剂的情形下，无论在溶液中或在蛋白质近旁都可以稳定存在。酪氨 酸羟基的酰化作用同胺的酰化作用相比通常很慢，但反应若得以完成，其产物酚酯也十分稳 定 。组氨酸咪唑氮的酰化作用生成不稳定加合物，其快速水解后重新生成未经修饰的组氨 酸;这一无效修饰循环是蛋白质依赖性水解的例证，其促进试剂消耗却未产生稳定的修饰。 醛与胺反应可逆性生成席夫碱，当 p H 低 于 5 时席夫碱大量解离；而用弱还原剂氰基 硼氢化钠处理则使其更加稳定，但氰基硼氢化钠的毒性是这种偶联方式的缺陷。虽然理 论上醛可与水反应，但产物双羟基会立即失水再生成醛；因此，在无还原剂或氧化剂的情 况 下 ，可认为醛是稳定的。 异硫氰酸醋、环氧化物和咪唑氨基甲酸酯与蛋白胺的反应相对缓慢，且仅在水中缓慢 分解。具有后两者的固相亲和介质在加人所要偶联的蛋白质溶液之前，能够与水样缓冲
    液作用进而被水合或清洗。 9. 3.3 n h s-p e o 4-b i o t i n 的生物素化反应 NHS-PE〇 4-biotin(Pierce)是一种典型的N H S 酯 ，如 图 9. 6 所 示 。亲水的四单位聚 乙婦氧化物(PEO ,也称为聚乙稀乙二醇或PEG)连接体使该化合物可溶于水，增加了加 合物的亲水性。该试剂是N H S 醋 修 饰 Ig G 的例证之一。 就该试剂而言，式（9. 1)的最佳动力学参数值可用于特定的一组反应条件___ 室温 PBS 孵育过夜（0 •15m o l/L N aC l，0. lm o l/L N aH 2PO4，用 NaOH 将 pH 调节至 7. 2)---- 对于任何浓度达到所需生物素化水平的IgG 均可计算出试剂浓度。将 图 9.7 参数值代入 式 （9. 1)中，以修饰水平m 为 1〜11，可绘制出同等修饰水平的等值曲线。正如式（9.2)所 示 ，关于参数M 的最佳值，不能认为每个IgG 分 子 129个胺就是实际可反应胺的数目；事 实上，一 个 分 子 中 胺 的 总 数 ，无论是否参与反应，仅约为9 0 个 。我们用这一试剂来说 明在两种截然不同的情况下，即大量IgG 以高浓度提供（ 范例流程1 ，图中右上部点）
    量未知数量的低浓度IgG (范例流程2,左下部点），达 到 每 个 Ig G 分 子 在 3 个生物素水平 进行修饰的生物素化作用（ 几乎在所有应用中均为适宜的修饰水平）。 9. 3. 3. 1 高浓度下大量IgG的生物素化作用 在范例流程 1 中，lm g (6.7nm ol) 正常人 IgG 溶于 90jm1 PBS(0. 15m 〇l/ L N aC l, 0. Im o l/L NaH2PO4，用 N a O H 将 p H 调节至7. 2)，被生物素化达到每分子3 个生物素水 平 ，总反应体积为1〇〇 4。如果蛋白质溶于其他缓冲液中，则必须通过透析或其他方法用 PBS加以平衡（9. 2.3节）。将 Im g 定为“大量”的分类似乎有些武断，但这里考虑的两个 主要因素是这一数量足以完成标准的理化测定，且足以随意操作而不必加入携带蛋白以 弥补由管壁表面吸附所引起的蛋白质损失。鉴 于 Ig G 的 终 浓 度 P 为 10mg/m l(67jLtmc> l/ L ，图 9. 7 右侧的垂直虚线），我们可由式（9. 1)计 算 得 出 达 到 修 饰 水 平 m = 3 的试剂浓 度只， R = = [ 3 - 25.6X l n (l - I ^ ) ] x 67 - 2274 X l n (l - I J ^ ) = 295|^〇 1〇 1/[(图9. 7 中水平虚线） 此处的动力学参数值取自图9. 7。相应地，可制备2. 95mmol/L 的稀释试剂，也就是终浓 度 的 10倍 ，取 10/lJ 加入90/x l蛋白质溶液中。 9. 3. 3. I.1 范 例 流 程 1:大 量 高 浓 度 IgG 的生物素化作用 ( 1 ) 向 1.5m l微 量 离 心 管 中 用 移 液 器 加 人 90W 浓 度 为 11. 3m g/ml 溶 于 P B S 中 的 IgG 0 ( 2 ) 向预装有 2m g(3.4/Limol)NHS-PE0 4-biotin 的 Pierce No-Weigh 型小管中用移 液器 加 人 100/x l二甲基亚砜（ DMSO) ，然后用移液器吸头穿破箔封；用吸头上下吹打使油 状固体完全溶解。 （ 虽然试剂可溶于水，但很难直接溶解水中的油状固体，在此过程中试 剂可发生显著水解；相反，试剂在干燥D M S O 中易溶解而且稳定，终反应混合物中痕量浓 度的溶剂对Ig G 是完全无害的。） ( 3 ) 向装 有 L 05ml P B S 的 I .5m l微量离心管中用移液器加入全部的lOOpl DMSO 溶 液 ，然后制成2. 95mmol/L 的稀释液；立即振荡混匀，向微量离心管内加人1(^1 Ig G ,振 荡混匀微量离心管，瞬时离心使溶液沉人管底，避 光 反 应 至 少 4h 。试 剂 与 Ig G 的摩尔比 是 4. 4 。 （ 用于计算适用于室温孵育试剂浓度的动力学参数；至 于 4°C 孵育的参数尚不明 确 ，但一般情况下可有所不同。 4h 的孵育无疑可以使反应充分完成—水解和修饰共同 消耗完所有的初始试剂。） ( 4 ) 向反应微量离心管中加人 l m i T B S (0. 15m o l/L N a C l, 50m m ol/L T ris •H C l p H 7. 5)，振荡混匀，然后转移至截留分子质量为3〇 k D a 的 C e n tric o n 微量离心浓缩装置 (M illip 0re) 中；再 加 人 700M1 T B S ;根据厂商说明书经4 个 循 环 浓 缩 至 50jul，进而去除未 结合的生物素，而 后 稀 释 至 I .8m U 再 一 次 浓 缩 至 50jul;然后向最终渗余物中加人400^1 T B S ，振荡微量离心浓缩装置确保所有的蛋白质从膜上清 除 ，根据厂商说明书用反转离心 法收集稀释的渗余物;最后将其转移到适当的容器中储存。微量离心浓缩装置适用于最
    大 量 为 Im g 的 Ig G ,相当于最大浓度为20mg/m l的 50/jJ 终止容积(完全浓缩的渗余物）。 对于更大量的蛋白质，可通过透析方法去除未结合的生物素（9. 2. 3 节）。 (5)如果不考虑损失，则从这一方法得到的最终450M 溶 液 其 Ig G 浓度的理论值应 为 2. 2mg/m U 浓度可根据经验通过分光光度法或B radford法测定，但由于有高浓度的 T ris (9. 2. 2 节）不要采用B C A 法测定。 Im g 范围内的初始Ig G 典型产率为8 0 % ，而大规 模的制备则可接近1 0 0 % 。 这一方法可按比例缩小到至少500Fg ，且可放大至无限，只需应用适宜的透析和（ 或） 浓缩装置去除未结合生物素，以及交换为所需缓冲液。 Ig G 的 浓 度 大 约 为 150jLxg/m l(范 例 流 程 2 的粗略上限），根据式（9. 1)调节试剂浓度可调整至溶解度的最大限度。 9.3.3.2 生物素化水平的检测 遗憾的是，精确测定生物素化水平是很困难的。标准生物素的测定依赖于分析物(所 要测定的生物素）与其他配体同亲和素或链霉亲和素的竞争性结合。例 如 ，4'-羟基偶氮 苯-2-羧基酸（ H A B A )试验中，分析物取代了 H A B A 染料与链霉亲和素或亲和素结合，因 此 ，500n m 处的摩尔消光率减少了约23 000(也 见 Hermansonm )。这种测定方法不很灵 敏 ，需要足量的20(V g /m l Bio-Ig G 加入试管或微板孔。而且与自由生物素不同，同蛋白 质偶联的生物素，不能封闭在四聚物亲和素或链霉亲和素分子上全部的四个生物素结合 位点，因而产生了严重的空间位阻效应;使得对结果的定量解释具有很大的不确定性。竞 争 性 E L IS A 作为下述范例流程3 的示例比H A B A 试验更为敏感，但仍充满不确定性，其 不仅来自于位阻效应也来自于多价效应。这些不确定性可通过下述方法加以消除：测定 前用酸性水解或链霉蛋白酶[1]或蛋白酶尺[3, 6]消化蛋白质进而使生物素释放。然而对于 一 个 像 N HS-PEO4-b io tin 那样很好的生物素化试剂，没必要进行这样的定量，因为实际 达到的生物素化水平不应该远离图9. 7 中的预测值或者式(9. 1)中动力学参数的适宜值。 9.3. 3 . 3 少 量 未 知 数量 低浓 度IgG的生物素化作用 在 范 例 流 程 2 中，假 定 终 反 应 混 合 物 中 Ig G 浓 度 未 知 但 不 超 过 l ^mol/LClSOjLtg/ m l)。如 图 9. 7 所 示 ，如此低的Ig G 浓度 下 ，达到给定生物素化水平m (如 每 个 Ig G 分子 三个生物素；图中左侧箭头所指示的点）所 需 的试剂浓度实质上并不依赖于Ig G 浓度。 应用式(9. 1)，设蛋白质浓度P 为 0,我们可推算出在极低I gG 浓度下达到生物素化水平 m = 3 所需的试剂浓度。 E f e K 1 - 昔 ) = - 2274 X 4 1 - 1 ¾ = 54— 娘 IgG 浓度并没有明确划分的下限，但在极低浓度下（ 少 于 l 〇〇ng /ml) IgG 吸附到管壁 上的损失则是不容忽略的。但生物素化作用完成后，大 量 BSA 携 带 蛋 白 质 被 加 人 BioIg G 中，因此，消除了进一步的吸附损失。范例流程中的终反应容积是IOjuI , 由 5^1 IgG 和 5/^1 lOSjumol/L试剂（ 给定的终试剂浓度是54jumol/L)组成；在此情况下， IgG 数量的 上限应是5jul PBS中 含 1. 5吨 。如 果 Bio-IgG 的浓缩生产通过范例流程3 中的ELISA滴 定法定量，则 必 然 会 损 失 一 些 Bio-IgG ,精 确 的 滴 定 需 要 50ng。 所 以 ，如果滴定损失了 33% 的终产物，则 Bio-IgG的总产量应该仅有150ng，仍然可以相当精确地进行定量。
    9 . 3 . 3 . 3 . 1 范 例 流 程 2 : 少 量 低 浓 度 IgG 的生物素化作用 ( 1 ) 向 500^1微量离心管中加人5沁溶于PB S的 IgG。 可以不必知道IgG 浓度，但不 能 _ 于 300jug/ml。 ( 2 ) 向装有 2m g(3. 4/xmol) NHS-PEO4-biotin 的 Pierce No-Weigh 型小管中加人 100/xl D M SO ,然后用移液器吸头穿破箔封， •用吸头上下吹打使油状固体完全溶解[见范 例 流 程 1 中步骤(2)]。 ( 3 ) 向装有3. 14ml P B S 的 4m l试管中加入IOyl D M S O 溶 液 ，制 成 lOSpmol/L 的稀 释液;立即振荡混勻，向微量离心管中加人5/^1 Ig G ，振荡混勻微量离心管，瞬时离心使液 体沉人管底，室温避光反应至少4h 。 (4) 向反应微量离心管中加人IOOpl lm o l/L 乙醇胺,用H C l将 p H 调节至9. 0;振荡 混匀，瞬时离心使液体沉入管底，室温避光孵育至少l h 。初始高浓度的胺消除了（ 与之快 速反应）任何残留的未水解试剂，确保下一步加人的B S A 不发生生物素化反应。 ( 5 ) 向 TBS(0. 15mol/L NaCl, 50mmol/L Tris •HCl pH 7. 5 )中加人 400/xl 2. 5mg/ ml B S A ，振荡混匀，转移至截留分子质量为3〇 kD a的微量离心浓缩装置中；再 加 入 I .3ml TB S ;根 据 厂 商 说 明 书 经 4 个 循 环 浓 缩 至 5 0 4 进 而 去 除 未 结 合 的 生 物 素 ，再稀释至 1.8m l;再次浓缩至50沁;然后向最终滞留物中加入l 〇〇 W TB S ,振荡微量离心浓缩装置， 确保清除膜上所有的蛋白质，根据厂商说明书用反转离心法收集稀释的滞留物;最后将其 转移到500沁微量离心管中储存。 B S A 作为携带蛋白，可 阻 止 Bio-IgG吸附到管壁上造 成进一步损失；仅当前面步骤中所有残留的未消耗试剂耗尽后才加人BSA。其加入的总 量 为 lm g ，充分溶解于50^1溶剂内—微量离心浓缩装置每一个浓缩循环可大约得到的 最小容积。 ( 6 ) 如果需要，最后制备过程中Bio-IgG的浓缩可通过下面的ELISA滴定法定量。 9. 3. 3. 4 E L I S A 滴 定 法 测 定 B io -I g G 浓度 在此过程中，一系列稀释的未知浓度的Bio-IgG样本和一个已知浓度的Bio-IgG标 准品与链霉亲和素包被的E L IS A 板各试样孔反& ;Bio-Ig G 的标准品和样品必须在种 属、同型分布（ 如果适用）和每分子生物素的数量等方面相匹配。最低稀释度的Bio-IgG 标准品浓度约为100nmol/L ;如果最低稀释的未知样本其Bio-IgG 浓度小于3nmol/L ，则 精确度将会大打折扣。未结合的Bio-IgG被洗脱，结 合 的 Bio-IgG可用酶联二抗检测。 该实验需要能够在约405n m 处 读 E L IS A 读板机（ 动力学读板机更为优越，但是单一的读 数装置也足以胜任），如有洗板机则会更方便。 9. 3. 3. 4 . 1 范 例 流 程 3 :用ELISA滴 定 法 检 测 Bio-IgG 浓度 ( 1 ) 在 50m l试 管 中 ，配 制 8. 5ml lO yg/m l溶 于 0. lm ol/L NaHCO3 的链霉亲和素 (取 自 lm g/m l水溶冻存液），用 N aO H 将 p H 调 至 8. 5 ; 向改良的平底ELISA板中每孔 滴 人 80^1;盖上盖子，使蛋白质包被在试样孔的塑料表面，在冷的湿盒中过夜孵育（ 密封 的塑料小盒底部带有潮湿纸塔以维持湿度）。 (2) 将 15ml Sea B lo ck封闭液（ Pierce;几乎任何其他的封闭液均可；这里的封闭液中 要避免使用牛蛋白，因为所需定量的Bio-IgG来自同一种属）与 15ml水混合；向每孔中滴 人 285^1，使孔充满。置该板(不盖盖子）于冷的湿盒中封闭至少汍。
    (3) 与此同时，用红色 TTB(含有 0. 5 % Tween20，lmg/ml BSA 和 100/xmol/L 酚红 的 TBS)作 为 稀 释 液 ，制 备 未 知 Bio-Ig G 样 本 的 稀 释 序 列 （ 通 常 为 倍 比 稀 释 ）以及 12〇 nrn〇l/L Bio-IgG 标准品；下一步骤中每孔需要50/xl，另外要多加10^1作为滴加误差的 补偿。在此例中，样品和标准品为生物素化达到相同水平的多克隆牛IgG;标准稀释品体 积 为 250jul(足以超过4 个 50W 的循环用量），最 小 稀 释 Bb-IgG 样 品 的 浓 度 为 120mn〇l/ L ;稀释样品体积为12(^1(足够超过两个50;xl循环用量）。 (4) 当 第 二 步 封 闭 完 成 时 ，用 TBS/Tween( 含 有 0.5% Tween 2 0 的 TBS) 洗漆 ELISA孔 ，可手动或用洗板机，用 15〇 W TTB(与 红 色 T T B 相同但不含酚红；如果有多通 道移液器，此步骤会更加便捷)快速加满试样孔（ 避免过干）。向孔中（ 已 经 含 有 1 5 0 4 未 染色的稀释液)加 入 50；xl前一步骤中的红色样品和Bio-IgG 标准稀释液（ 使 Bio-IgG 成 4 倍稀释红色可避免对样本孔的遗漏或重复加样。盖上盖子在冷的湿盒中至少孵育2h; 在此期间，Bio-IgG 分子被固相化的链霉亲和素所捕获。 (5) 将 12. 5ml T T B 与适量(见此步骤最后一句话）的碱性磷酸酶（ AP)酶联二抗混 合;如前所述洗涤ELISA板;每孔滴入10(^1二抗稀释液（ 当然如果有多通道移液器此步 骤会更便捷）；盖上盖子，在 冷 的 湿 盒 中 孵 育 2. 5h。 A P 酶联二抗的特异性显然取决于 Bio-IgG 的来源。此例中，IgG 为多克隆牛源蛋白，应 用 3. 5/ml Southern Biotechnology公司 的 AP 酶联山羊抗-牛 IgG(H+ L) (Cat# 6030-04; Birmingham, AL);3. 5jul 的体积是由预实 验决定的，当固相的链霉亲和素被BkHgG饱和后，足以显示很强的ELISA信号(下一步）。 (6) 前一步骤中即将完成2. 5h 的孵育时，将 10ml lm o l/L 二乙醇胺（ 用 H C l将 pH 调 节 至 9. 8)、10pl lm o l/L M gCl2 和 100/xl 50mg/m l冻存的憐酸对硝基苯醋（ 》 -nitrophenylphosphate)混合制成底物溶液。如前述洗涤E L IS A 板 ，每孔中加人90^1底物溶液，速 度要快，避免过度干燥（ 如有多通道移液器此步骤会更便捷）。 405n m 和 490m n处光密度 (OD)值的差异通过动力学读板机在57m in 内 每 隔 3m in 读测一次，每孔可以得到一个斜 率值(mOD/m in)(Im O D 等 于 1/1000 OD) ，以此作为E L IS A 的采集信号（ 如果没有动力 学读板机，30〜60m in 后 在 405n m 处单独测量O D 值也可以代替斜率）。图 9. 8 显示了范 例实验的结果。最小稀释因子是4,表示步骤(4)中 为 4 倍稀释。两个滴定曲线的比较表明
    Bio-IgG标准品浓度是Bio-IgG样 品 浓 度 的 36. 9 倍,标准品浓度为120nm〇l/L ;因此，估算 BkHgG样品浓度为3. 25nm〇l/L 。事实上，实验中“未知样本”的 浓 度 为 3.75nm〇l/L ;因 此实验低估了真正的Bio-IgG 浓度约1 3 % —多数情况下这属于完全可接受的误差。从 图中明显可见，如果“未知样本”浓度小于l nm〇l/L ,则测定精确度会有所影响。 9 . 3 . 3 . 5 固 相 生 物 素 标 记 多 数 IgG 在重链近C 端有三个高度保守的、暴露于溶剂的一个组氨酸簇。此氨基酸 簇存在于人类IgG l、IgG2 和 IgG4(但不存在于IgG3 中），鼠 IgG l、IgG2a 和 IgG3(但不存 在 于 IgG2b 中），兔 IgG 以及牛IgG 中。所以，多数纯化的IgG 可被含镍的固相金属亲和 色谱(IMAC)介质所捕获（ IM AC 对 于 捕 获 全 血 清 中 的 IgG 是 无 效 的 ），尚不清楚如人 IgG3 和 鼠 IgG2b 这类仅有部分组氨酸簇的IgG 是否也与镍柱结合。当蛋白质固定于镍 柱时，这种结合可用于NHS-PE0 4-biotin进 行 IgG 的生物素化[7]。固相生物素化反应的 优势是试剂的加入和未偶联生物素的清除可以仅通过试剂流动或洗涤缓冲液过柱来实 现 ，此后，生物素化的IgG 可 用 含 有 〇.2mol/L 的咪唑缓冲液从柱中释出。但 是 ，如果在 应用生物素化抗体之前，浓缩的咪唑必须被清除，那么这一优势将不复存在。固相生物素 化反应的动力学十分复杂，尚未完全明确。达到给定修饰水平所需的试剂浓度似乎比传 统液相反应高。尚不清楚反应过程中究竟是溶液中位于IM AC 柱上游还是下游区段的 试剂与固化的IgG 接触机会更多。 9 . 3 . 4 用 荧 光 染 料 进 行 标 记 AlexaFluor647 竣酸號拍醜亚胺醋（ AF647NHS;Molecular Probes， Eugene, OR)是 一种典型的胺反应性荧光染料；其结构被专利保护，给出的分子质量为125〇 Da。当偶联 到蛋白质上，其 在 650nm 处 具 有 最 大 吸 收 峰 ，摩 尔 消 光 系 数 为 239 000,散射最大值在 665nm 处;其在280nm 处 （ 近于所偶联蛋白的最大吸收峰位置）的 吸 收 值 是 6 5 0 m n 处的 3 % 。前述的光谱参数因染料不同而异。在这一范例流程中，AF647N H S 与 牛 IgG 进行 反应。透析清除未结合的染料后，通•过分光光度法分析荧光变化，进 而 确 定 I g G 浓度和 每 个 IgG 分子所结合的染料分子数量。由于荧光染料是光敏感性的，所以应在弱光下操 作 ，如果可行最好完全避光。 9. 3. 4. 1 范例流程 4 : 用 AlexaFluor647 标记 IgG ( 1 ) 向 1.5ml 微 量 离 心 管 中 加 人 IOmg 溶于 606jUl l 〇PBS(0. 15mol/L NaCl， 5mmol/L NaH2PO4，用 NaOH 将 pH 调节至 7. 0)和 67//1 lm ol/L NaHCO3 中的 IgG,用 NaOH将 p H 调 至 8. 5。 LoPBS的弱缓冲能力使得可以通过加人少量浓缩缓冲液而将 p H 重新调节至所需数值(本 例 为 8. 5)。 ( 2 ) 向装有Img AF647N H S 的试样管加入1〇〇沁DMSO,通过剧烈振荡混匀使之完 全溶解（ 浓 度 为 10mg/ml = 8mmol/L);将 5〇 W 加入前一步骤的微量离心管内，立即振荡 混 匀 ；瞬 时 离 心 使 溶 液 沉 入 管 底 ；4° C 避 光 过 夜 孵 育 。 IgG 和 试 剂 的 终 浓 度 分 别 为 92pmol/L 和 553jumol/L0 (3) 加 人 IOOmI 3mol/L 乙醇胺，用 H C l将 p H 调 节 至 9;室温避光孵育I h 以消除未
    反应的试剂[见范例流程2 中的步骤(4)]。 (4) 将 反 应 混 合 物 转 人 一 个 4m l管 中 ，用 LoP B S 稀 释 至 总 容 积 3m l，继 而 用 I LoPBS进行透析，换 液 3 次 。 (5) 从透析袋或盒内移出透析的IgG ,通过微量离心浓缩装置经过两个循环浓缩至 610^1(如果不需得到高浓度的标记IgG 则不必进行浓缩）。 (6) 以 LoPBS作为稀释剂，制 成 500ptl 1/100的稀释液，从 220〜320n m 以 及 610〜 690nm 进行分光光度扫描，LoPBS作为参照溶液。光谱如图9. 9 所示。因 650m n处的吸 收峰值为0. 778,稀释因子为1〇〇,给定的染料摩尔消光系数为239 000,故染料浓度推算 为 325. 5^mol/L 。 280n m 处 加 入 染 料 （ 〇.7 7 8 的 3 % ) 后 的 纠 正 吸 收 峰 值 为 〇.214,故 280nm处 Ig G 的吸光度值推算为〇.190 66;由于稀释因子为1〇〇,IgG 的摩尔消光系数为 210 OOOCLmg/ml溶 液 的 吸 光 度 值 为 1.4)，故 推 算 Ig G 浓 度 为 90.8叫 〇1/乙（13.611^/ ml)。所以，每 个 Ig G 分子所偶联的染料分子数目是325. 5/90. 8 = 3.6;这一修饰水平几 乎不会封占大部分的抗原结合位点，却足以通过激光扫描共聚焦显微镜进行鲜明的免疫 细胞成像。 IgG 的终产量为〇• 61mlX 13. 6mg/ml = 8. 3mg，或 者 初 始 Ig G 的 8 3 % --- 这 是多步反应中典型的完全可以接受的产率。值得注意的是，由 于 在 32〇n m 和 690nm处 均存在显著的残余染料光吸收，故未作光散射纠正（9. 2. 2. 1 节）上述方法对较广范围的IgG 数量和浓度均可适用。但 是 ，由 于 对 AF647N H S 的修 饰动力学研究尚不如NHS-PE〇 4_bi〇tm 深 人 （ 图 9. 7) ，因 此 如 果 Ig G 的浓度、温度、 pH 或缓冲液构成与此案例完全不同时可能需要对试剂的浓度范围进行摸索。 9 . 3 . 5 巯 基 的 导 入 IgG 本身很少或不含自由的巯基（ 图 9.14)，但可通过一个末端胺反应基团与另一端
    巯基的异源性双功能交联方法人工引人巯基。大多数情况下，硫醇化作用的目的是使抗 体偶联到酶或其他由巯基反应性马来酰亚胺基团衍生而来的蛋白质上（ 见 9. 8 f h S A - T A (iV-succinimidyl S-acetylthioacetate)是实现该功能的一 种 典 型 交 联 剂 ，其胺反应性 N H S基团与硫醋相交联，可被认为是巯基的一种保护形式。 S A T A 与 IgG 反应 时 ，其某 些氨基基团的酰基化产生含有硫酷的加合物，如 图 9. 1 0 上部所示。在缺乏亲核溶质时， 硫酷比自由巯基更为稳定。被保护的巯基用羟胺处理后在温和情况下仅在临用前去除保 护 ，产生如图9. 1 0 底部的加合物;产生的含有巯基的IgG 应立即使用，以避免巯基的氧化 或其他副反应所造成的渐进性损失（9. 4.3 节）。范例流程5 是 以 Pierce公 司 的 S A T A 说 明书为蓝本的9. 3. 5. 1 范 例 流 程 5 : S A T A 的 巯 基 化 作 用 ( 1 ) 向 1.5m l 微 量 离 心 管 内 加 人 Im l 溶于 P B S C 0. 15 m o l/L N aC l，0. I m o l/L N aH 2PO4，用 NaOH 将 pH 调节至 7.2)中的浓度为 9m g /m l(60/xm ol/ L ) 的 I g G 。 (2) 将 S A T A 溶 解 于 D M S O 中 ，浓 度 为 5. 36mg/m K 55mmol/L );向前一步骤的微 量离心管内加人10W ，立即振荡混匀，室 温 反 应 30m in 。 Ig G 和 S A T A 的终浓度分别为 59. W m ol/L 和 545/^mol/L ;因而最后的修饰水平被认为是每个I gG 分 子 3〜3.6 个保护 性巯基。与 S A T A 反应后并不适合用乙醇胺来消除未反应试剂[见于范例流程2 步骤 (4)]，因为高浓度乙醇胺可以使巯基过早地去除保护。 ( 3 ) 可 用 PBS透析或使用离心浓缩装置用P B S 进行多步循环稀释和浓缩来去除未 反应和已水解的S A T A ;用分光光度法、B radford法 或 B C A 法测 定 I gG 浓度（9. 2. 2 节）。 Ig G 的确切终浓度并不重要，在下一步骤中起始浓度假设与9rng/ml 相差不多。制成的 Ig G 可储存于冰箱或冰柜中数月或数年。 ( 4 ) 如需去除IgG 的保护，则向微量离心管中加入所需剂量的衍生I gG 及 〇.1 倍体 积新鲜制备的脱酰溶液（ I.74g 羟 胺 •H C l和 0. 365g E D T A 二 钠 溶 解 于 40ml PB S中； 加水至终体积50ml;用 NaOH将 p H 调 节 至 7. 2);振荡混勻，离心使溶液沉人管底，室温 反 应 2h 。 ( 5 ) 通 过对 P B S /E D T A ( P B S 加 人 10m m o l/L E D T A ) 的透析或用离心浓缩装置对
    PBS/ED TA进行多步循环稀释和浓缩来清除反应物；用分光光度法、Bradford法 或 BCA 法 测 定 IgG 浓度。 (6)用 EUm an氏试剂对巯基进行定量（ 范例流程8)。 E D T A 使巯基避免金属催化的氧化反应；不过，因 为 E D T A 不能避免所有方式的巯 基损失，所以去保护的IgG 应尽快使用。 9.3. 6 聚乙二醇化 将 PEG链连接到治疗性的单克隆抗体上可能显著改变它们的药代动力学特性[8]。 多聚物链极度亲水且在周围形成了广泛的水化外壳，继而倾向于排阻邻近的大分子。这 种容积排异效应可延长血清IgG 的半衰期，阻 止 其 与 抗IgG 抗体和其他高分子的结合。 Larson及其同事[9]研究了用NH S 酯 mPEG-SPA 对 IgG 进行聚乙二醇化修饰后的动力 学效应，mPEG-SPA具有一个平均相对分子质量为5000的 PEG链 ，产生的加合物结构 如 图 9. 1 1 所示。 〇 H3CZ0 H - ^ O IH 图 9 . 1 1 应 用 胺 反 应 性 聚 乙 二 醇 化 试 剂 进 行 IgG 聚 乙 二 醇 化 修 饰 后 的 示 意 图 。 3mg/ml(2(^mol/L)指 定 浓 度 的 IgG 与 不 同 浓 度 的 mPEG-S P A 反 应 ，由于缺乏对 PEG敏感的简单颜色反应，其最后的修饰水平需用核磁共振来测定。与式（9. 2)相符，修 饰水 平m 与试剂和蛋白质之比只/P 成比例，在此反应条件下比例常数为0.73。范例流 程 6 基 于 Larson等的文章[9]。 9. 3. 6.1 范 例 流 程 6:应 用 mPEG-SPA进行聚乙二醇化修饰 (1) 将相对分子质量为 5000 的 mPEG-SPACShearwater Polymers Inc， Huntsville， AL)溶 解 于 DM SO中，使其浓度高于下一步骤最终浓度至少2 0 倍以上（ DMSO的终浓度 因此不超过5 % ) 。 (2) 将 溶 于 p H 9. 2 硼酸盐缓冲液的3mg/m lIg G 溶液，搅拌或振荡中逐滴加人所需 体 积 的 mPEG-S P A 溶液。 mPEG-S P A 与 Ig G 的摩尔比及A P 应高于所需修饰水平m (每 个 Ig G 分 子 P E G 链的数目）的 1/0. 73 = 1. 3 7 倍 。室温持续搅拌反应l h ，4°C 过夜。 (3) 通过截留分子质量为50〜IOOkDa的离心浓缩装置多步循环浓缩和再稀释，去除 未结合的PEG，交 换 为 PBS。 (4) 通过分光光度法测定蛋白质浓度。 (5) 如果有核磁共振设备，可用所述方法对每个I gG 分子所偶联的P E G 链数目进行 测定。 9 . 3 . 7 与 螯合剂的偶合 胺反应性螯合剂可通过双功能交联将放射性金属连接到抗体（ 或其他蛋白）上 ，进行 放射性治疗或活体成像[1°，11]。标记过程包括两个阶段。第一 步 ，将空螯合剂（ 即没有金9. 3. 7. 1 范 例 流 程 7:应 用 DTPA异硫氰酸盐衍生物进行修饰 (1) 将 46;x m o l/L IgG 溶于 〇.15m o l/L N a C l 与 50m m o l/L N -(2-轻乙基）脈曝-N -乙 磺酸（ HEPES)中，用 N aOH 将 PH 调 节 至 8. 6,向其中加入适量体积的l 〇m m ol/L 新鲜 制 备 的 水 溶 D T P A 异 硫 氰 酸 盐 衍 生 物 ，体 积 如 前 文 所 推 算 ；反 应 在 27°C条件下进 行 17. 3h。 (2) 通过 PBS透析法或使用离心浓缩装置，用 PBS进行多步循环稀释和浓缩来去除 未结合的D T P A 。 (3) 应用分光光度法、Bradford法或B C A 法测定蛋白质浓度。 在前述研究中[12]，可应用1M 3B-D T P A 的14C 标记型，通过闪烁计数来测定修饰水平 m 。后来，一种简单的比色法也可用于没有标记型试剂时D T P A 滴定定量[13]。 9. 4 巯基和二硫键的修饰 9.4.1 Ig G 的二硫键和巯基 免疫球蛋白由多个具有保守结构的同源单位组成，称为免疫球蛋白折叠。每个免疫 球蛋白折叠内具有单一的髙度保守的链内二硫键；图 9. 1 4 为 普 适 IgG 示意 图 ，方括号表 示二硫键。打断这些键需要涉及参与的反应半胱氨酸使得抗体变性；不在本章讨论范围 之内。 链间二硫键连接在两个重链的铰链区附近以及重链与轻链之间，如 图 9. 1 4 虚线所 示 。这些键的数量和确切位置因种属及亚类的不同而各异，但在特定种属的特定亚类的 Ig G 中是高度保守的，不论其可变区序列和抗原结合特异性如何。由于这些接触溶剂的 链间二硫键通常可在IgG 未变性或抗原结合能力未被破坏的情况下断裂，所涉及的反应 属于本章的内容范畴某 些 IgG 在重链恒定区有额外的链内二硫键。例 如 ，兔 IgG 就具有这样的二硫键，
    属配体的螯合剂）共价偶联到抗体（ 或其他生物分子）上 ，产生可以永久储存的稳定加合 物 。第二步，一部分螯合剂偶联的加合物与放射性核及自由未结合金属反应；由于所用的 放射性核素半衰期短，故第二步反应必须快速进行并且形成的加合物应立即使用。 由于二乙烯三胺五乙酸(D T P A ) 的胺反应性衍生物在适宜温度下可迅速发生螯合作 用 ，所以非常适合于标记抗体。 D T P A 有效地螯合9°Y (用于放射性治疗的《、卩射线源严 Y (用于正电子发射断层扫描成像的射线源）111In(用于单光子发射计算机断层扫描成像 的 7 射线源）以及其他放射性核素。两 种 D T P A 的胺反应性异硫氰酸盐衍生物可通过商 业途径从Macrocyclics(Dallas， T X )公司购得，M irzadeh及 其 同 事 已 经 对 第 三 种 1M 3BD T P A 的反应动力学进行了广泛研究[12]。范 例 流 程 7 就依据了他们的文章；与 1M 3BD T P A 反应形成的硫脲加合物如图9. 1 2 所示异硫氰酸盐与胺（ 以及与水）的反应速度同在范例流程1 ， 2 和 4〜6 中 的 N H S酯相 比更为缓慢；即 使 经 过 35h 与 1M3B-DTPA的反应后偶合仍不完全[12]。因此式 （9. 1) 和式 （9. 2 )不能被确信可用于从已知反应条件推断未知条件。应 用 范 例 流 程 7 的反应 条件与浓度为lejumol/L 的 Ig G 反 应 ，作 者 针 对 一 些 不 同 的 试 剂 与 IgG 摩尔比尺A P 测 定了修饰水平m ，结 果 如 图 9. 1 3 所 示 。数据与经验公式 （ 不以任何的动力学模式为基 础）完 全 吻 合 m =9. 939 X [l — exp( — 0_ 045 33只/ P ) ] (图中的连续曲线 ）， 因此可用于 推 算 修 饰 46^m o l/L Ig G 达 到 任 何 修 饰 水 平 m 所 需 的 试 剂 浓 度 。很 有 可 能 （ 但经验上 并未证明）商 品 化 的 DTPA异硫氰酸盐衍生物对Ig G 的修饰表现出非常近似的动力学 效应。
    在蛋白质未变性时可受到影响（ 图 9. 28)。除了恒定区的链内和链间二硫键，Ig G 个别分 子类型（ 如单克隆抗体)在其可变区有独特的巯基或二硫键。 自由巯基(非二硫键)一般在 Ig G 中极为宇见。 9. 4. 2 二硫化物的互换反应 二硫化物的互换反应是细胞内巯基/二硫化物转换以及体外掌控巯基与二硫化物的 基础。最小的二硫化物互换仅涉及偶联于基团R 和 R '的不同的两个硫，如 图 9. 1 5 所示。 即使这个最小的反应也包括了 4 个同时发生的平衡过程：在无电荷巯基与负电荷硫醇盐 型巯基之间的两个酸碱平衡以及两个二硫物互换反应本身。现实 中 ，典型的二硫互换反 应可能涉及大约1 2 个不同的巯基以及成百上千个同时发生的平衡过程。但 是 ，无论系统 多么复杂，尽管因平衡常数和最初的反应物浓度不同，二硫键的分布可显著不同，却都不 会造成二硫键的净值增加或减损。 显而易见，如果少量含有二硫键的蛋白质（ 图 示 R 'SSR。，用过量摩尔数的含巯基试 剂（ 图 示 RSH) ，如巯基乙醇处理，则两个二硫化物互换的平衡压倒性地趋于上行。净效 应是将几乎所有最初位于蛋白质中的二硫键转移至试剂上（ 图 示 为 RSSR) ，同时释放无 二硫键的蛋白质（ 图 示 巯基对R 'S^/R'S H )。在此情况下加人的R S H 巯基被认为已经 “裂解”或“减少”了所有的蛋白质二硫键。相反地，如果用过量的含二硫键试剂RSSR(如 胱胺）处理少量不含二硫键的蛋白质R S H ，上述二硫化物的互换平衡则势必趋向下行， 以致几乎所有蛋白质均转化为混合的二硫化合物R S S R ,其 中 R 通过二硫键结合到几乎 所有蛋白质巯基上。 由于自由巯基易受酸碱平衡影响，如 图 9. 1 5 所 示 ，得到的硫醇盐型巯基的百分比取 决 于 p H 。小型模式化合物中半胱氨酸残余硫醇的PK S为 8 〜9,而天然蛋白质巯基的 PKs 因其直接的微环境差异与该范围显著不同。小的烷基硫醇，如巯基乙醇的PK S 约为 9. 5 。因此，二硫化物互换反应通常在弱碱性p H (约 为 8)下进行。反 之 ，使样本酸化至 p H 约 等 于 5 或更低，一般可大大减少二硫化物的互换反应。 构象的限制可大大改变二硫化物互换反应的平衡，如 Cleland氏试剂二硫苏糖醇(D TT) 和二硫丁四醇(DTE)[14]，其两个巯基生成二硫键的反应分为两步（ 图 9. 16)，第二步反应实 质上是不可逆的。这种不可逆性源于混合二硫键的巯基更易于攻击D T E 或 D T T 来源 的硫而不是蛋白质来源的硫，因此分子内二硫键可形成非常稳定的六元环，进而从数量上 减少了 D T E 或 D T T 可触及的蛋白质二硫键，即 使 D T E 或 D T T 摩尔数仅轻度过量。
    天然蛋白质包括Ig G 中的巯基和二硫键，同小型模式化合物中的巯基和二硫键相比 其行为往往大不相同。其中一些在非变性条件下常不能暴露，如前面所强调的每个免疫 球蛋白折叠中的保守型链内二硫键（ 图 9. 1 4 中的实线括号）。而其他的一些尽管可能接 触 （ 至少可以接触小分子），但高度的构象限制也许会使平衡压倒性地趋向某个方向或另 一方向，正如前面图示中D T E 和 D T T 的实例一样。例 如 ，p H 为 5 时 ，10 m m ol/L 2-巯 基乙酰胺（2-mercapt〇ethylam ine，2-M E A )能 够 优 先 还 原 兔 Ig G 在非变性条件下重链之 间的成键，而并未切断其他的二硫键，包括重链轻链间的链间二硫键（ 图 9. 28)[15]。关于 不同单克隆抗体的链间二硫键在各种情况下优先断裂的研究最近已经发表[16]。 在 Ellman 氏试剂 5,5’-dithio-6zV(2-nitrobenzoic acid) (D T N B ;图 9. 17)[17]以及 2, 2’-出1;11丨〇?5^出116(2,2'七丁？）和 4：，4’-£1 丨 1 ：]1丨〇卩}^〇 1丨116(4,4’七丁？；图 9.18)[18]中的对称性 芳香基二硫键通过普通烷基硫醇(包括蛋白硫醇）的作用可发生不可逆性还原，形成混合 二硫键和一个高度显色的解离基团。解 离 基 团 分 别 为 D T N B ( 图 9. 17)的 5-thio-(2-nitrobenzoicacid)(T N B )以 及 4,4’-D T P (图 9•18)的4-thiopyridone(4-T P )。颜色的增加 可用于对Ig G 或其他蛋白质中的自由巯基进行定量，在范例流程8 中将举例说明。如果 在第二阶段反应中第二个烷基硫醇攻击混合二硫键，则几乎总是攻击烷基硫而不是芳 香 基 （ 试剂）硫 ，因此可形成与第一阶段反应同样的有色解离基团（T N B 或 4-TP ) 。图 9. 1 8 表 明 了 如 何 利用这一特性偶联两个巯基R S H 和 R 'S H (如两个含有巯基的蛋白 质）生 成 一 个 二 硫 键 加 合 物 RSSR'[19]。第 一 步 ，R S H 与 过 量 的 4,4'-D T P 反应形成混 合二硫键，释 放 4-T P 解 离 基 团 和 过 量 的 4 ，“ -D T P 试 剂 。第 二 步 ，混合二硫键与大致 等 量 的 R 'S H 反 应 形 成 终 产 物 RSSR'加 合 物 。两个步骤均可通过分光光度法监测其 数 量 。
    图 9. 17 E llm a n 氏 试 剂 5 ,5 ^ d ith io - 6 z V ( 2 - n itr o b e n z o ic a c id ) 还 原 释 放 混 合 二 硫 键 以 及 强 有 色 疏 基 2 -n itro b e n z o ic a c id 。 图 9. 1 8 用巯基RSH还原过量4 ，W-DTP生成混合二硫键，随后混合二硫键与第二个巯基R'SH 反应，通过二硫键将R 与 W偶联在一 起 。 两步反应均释放强有色基团4-TP。 9. 4. 2. 1 范 例 流 程 8:应 用 Ellman氏试剂（ DTNB)测定自由巯基 ( 1 ) 新 鲜 制 备 的 l 〇〇 m m ol/L (l5. 4m g/m l)DTE(或 D TT)溶 液 ，溶于弱酸性 缓 冲 液 (5m m ol/L 乙酸，用 N aO H 将 PH 调 节 至 5)中 ；用相同缓冲液作为稀释液，进行系列 线 性
    稀释，范围涵盖O〜gOpmol/LC因每个 D T E 分子具有两个巯基，故 巯 基 为 O〜180/zmol/ L ); 这些就是 D T E 的标准品。 (2) 再次应用弱酸性缓冲液作为稀释液，稀释未知蛋白质（ 或其他样本），使预期巯基 浓度为60〜180Mm ol/L(如果预期巯基浓度具有超过三倍的不确定性，应准备合适的稀释 系列）。 (3) 称 量 1〜3mg D T N B 加人配衡的玻璃小瓶(用湿纸巾擦拭并且干燥以消除静电) 内；再 次 称 量 记 录 确 切 净 重 ；溶 解 于 足 量 lm o l/L PH = = 8 的 T ris •H C l中，使浓度为 0. 8m g/m l (2mmol/L )。在 I .5ml 微量离心管内用水稀释到 1/7,将 286； m io l/L DTNB 溶 于 143m m ol/L T r is 缓冲液中。 ( 4 ) 向 500/x l微量离心管或E L IS A 板孔内小心加人150/x l上述混合液。每孔中再加 人 50ju l步骤（1)的 D T E 标 准 品 或 步 骤 （2)中蛋白质样品之一，用移液器吸头搅拌混匀 (150沁D T N B 混合液中143m m ol/L p H 为 8 的 T r is 可 压 倒 D T E 标准品或蛋白质样品 中 5m m ol/L p H 为 5 的乙酸）。使颜色反应至少进行15m in。 (5) 用分光光度法测定412n m 处 （ T N B 解离基团的最大吸收峰处；图 9. 17)的吸光 度值，或者应用酶联免疫吸附试验分析仪（ 分 析 仪 在 405n m 处 读 取 的 结 果 如 图 9. 1 9 所 示)测定附近波长的光密度值。推算最佳的拟合直线绘制D T E 的标准曲线（ 图 9. 1 9 ) ;应 用直线的斜率和截距可以换算未知蛋白质样品吸光度值或光密度值与相对应的巯基 浓度图 9. 1 9 应 用 Ellman氏试剂5,5Ldithi〇-6zV(2-nitrobenzoic acid)滴定巯基；详见范例流程8。填充 的菱形为DTE标准品所观测到的光密度值;实线为数据的最佳线性拟合。 应用酶联免疫吸附试验分析仪会引人小的误差，因为蛋白质样品在塑料孔内形成弯 曲凹液面，而在打湿塑料面时由于D T E 标准品不含蛋白质，液面呈水平。为了消除这种 视觉误差，可应用比色皿通过分光光度计来测定标准品和样品的吸光度值。如果蛋白质 的巯基含量很低，则需要很高浓度的蛋白质才能达到相当的精确数值，或 许 在 412n m 处 会有一些由光散射或杂质造成的背景吸收。在此情况下，可以用分光光度计扫描365〜 465n m 处标准品和蛋白质样品的吸光度值，从而能够更精确地测定T N B 解离基团的吸 收谱
    9. 4. 3 其他涉及巯基和二硫键的氧化■ •还原试剂 如果参与反应的巯基具有恰当的几何关系得以彼此接近，则可以被弱氧化剂，如亚碘 酰基苯甲酸（iodosobenzoic acid)氧化为二硫键[2°’ 21]。然而，g卩使没有额外的氧化剂，空气 中溶解的氧也能够在中性和碱性条件下将巯基缓慢氧化成为二硫键；这种空气氧化可被 痕量重金属污染物所加速。通常可采取三种措施来避免不期的空气氧化：尽 可 能 将 pH 降低 至 5 或以下，加人螯合剂（ 如浓度至少为 i m m 〇 l / L 的 E D T A ) 压制重金属离子，用氮 或其他惰性气体清除溶解的氧。小的烷基硫醇,如巯基乙醇极易受空气氧化影响，因此应 在使用前数小时内制成。另外，二硫键六元环具有高稳定性，D T E 和 D T T 较为耐受空气 的氧化（ 图 9. 16);储 存 液 可 置 于 冰 箱 中 数 月 而 极 少 丧 失 效 能 。下 文 所 述 的 T C E P 比 D T E 和 D T T 具有更强的抗氧化性。 如图 9. 20 所 TK tri-carboxyethylphosphine(TCEP)可 还 原 二 硫 键 ，一■个TCEP 分子 能够释放两个巯基，从 而 氧 化 为 T C E P 的 氧 化 物 。 T C E P 作 为 二 硫 键 还 原 剂 同 D TE 和 D T T 相比至少有三个重要的优点。第 一 ，反 应 本 质 上 是 不 可 逆 的 ，可在非常宽的 p H 范 围 内 进 行 。第 二 ，如上段末尾所提到的，T C E P 具 有 抗 空 气 氧 化 性 ，储存液可在 相 当 长 的 时 期 内 保 持 稳 定 。第 三 ，T C E P 同 烷 基 化 试 剂 的 反 应 远 远 低 于 同 巯 基 的 反 应 。 亚硫酸分解（ sulfitolysis)[22]通过氧化而非还原方式断裂二硫键，如 图 9. 2 1 所示。生 成 的 S-磺化半胱氨酸残基在中性pH 下较为稳定，但半胱氨酸硫醇在过量巯基，如 DTE 或巯基乙醇处理后，很容易再生。虽然具有这些潜在的优点，但尚无关于非变性条件下 Ig G 二硫键被亚硫酸分解的明确研 究9. 4. 4 用 卤 代 烃 和 N-烷 基 马 来 酰 亚 胺 进 行 硫 醇 的 烷 基 化 卤代烃和N -烷基马来酰亚胺是中度亲电子的试剂，优先与硫醇盐型的巯基反应，形 成稳定的硫醚（ 如烷基硫醇)加成化合物，如 图 9. 2 2 所示。卤代烃和烷基马来酰亚胺的最 佳 反 应 p H 分别约为8. 5 和 7. 0;在最适条件下，试剂均与巯基发生反应并具有选择性。 当远低于最适p H 时 ，硫醇盐型巯基数量很少以致反应非常缓慢；当 p h 远高于最佳值 时 ，其他蛋白质亲核试剂，尤其是胺可与巯基反应。为了确保选择性，通常所加入的烷化 试剂摩尔数仅轻微超过反应巯基的总浓度。如果通过加入巯基还原剂D T E 或 D T T 产 生蛋白硫醇，则所加的烷化试剂摩尔数应略高于还原剂硫醇（ 如 为 D T E 或 D T T 浓度的 两倍）。但 是 ，如果通过加人TCEP生成蛋白硫醇，则烷化试剂摩尔数仅需要多于蛋白硫 醇本身，因 为 TCEP很少与此类试剂反应。当 PH 大 于 7 时 ，JV-烷基马来酰亚胺水解为 相 应 的 iV-烷基马来酰胺酸;不过其在水溶液中甚至比N H S 酷更加稳定。胺 反 应 性 NHS 酯和巯基反应性N -烷基马来酰亚胺作为异源双功能交联试剂均利用了这一相对的稳定 性 。第一步，如范例流程1 所述，交联剂被偶联到蛋白质的氨基上，生成带有大量巯基反 应性马来酰亚胺附加物的修饰性蛋白；马来酰亚胺基团十分稳定，可以接受这类处理。第二 步 ，马来酰亚胺修饰的蛋白质与含有巯基的分子进行反应，后者也可以是另一种蛋白质。干 粉状的马来酰亚胺修饰蛋白能够冻干永久储存而不会丧失马来酰亚胺的反应性。大量此 类的马来酰亚胺修饰蛋白可通过商业途径获得（9. 8 节将对交联作进一步讨论）图 9. 2 2 用卤代烃和JV -烷基马来酰亚胺烷化蛋白巯基形成稳定的硫醚加成化合物。 范例流程9 以 Pierce公司的说明书为基础，用 maleimide-PE0 2-b io tin (图 9. 23)将 IgG 链间二硫键的半胱氨酸生物素化，如同 N HS-PEO4-b io tin 的应用（ 图 9. 6)，两者均具 有亲水的P E O 连接体
    9. 4. 4. 1 范例流程 9 :应用 M a le im id e-P E O 2-B io tin 生物素化 Ig G ( 1 ) 向 Im l 溶于还原缓冲液(0. lm o l/L N aH 2PO4，2. 5m m o l/L Na2E D T A ,用 NaOH 将 pH 调节至 6. 0)浓度为 2. 5m g/m l 的 IgG 溶液中加入 6mg 2-mercaptoethylamine(2- M E A )并溶解;2-M E A 终浓度为53mmol/L ;溶 液 37°C 孵 育 90m in。这些条件可以切断重 链-重链间的链间二硫键，而完整地保留其他二硫键(包括重链-轻链间的链间二硫键）。 (2) 应用脱盐凝胶过滤柱（ 如 Pierce公 司 的 D-Salt)快 速 去 除 2-M EA，并且用结合缓 冲液(溶于PBS的 lmmol/LNa2EDTA)重新平衡蛋白；将 IgG 稀 释 至 2.5ml(理论浓度 为 lmg/ml)。脱盐柱进行的缓冲液交换远比透析袋或盒或离心浓缩装置快速，因此减少 了二硫键的再氧化。 (3) 将 2mg maleimide-PE〇 2-biotin(Pierce No-Weigh tube)溶于 lOOjul DMS◦ 中；向 2. 5m l还原 性 Ig G 溶液中加入25^x1;混勻，室温反应至少2h 。 ( 4 ) 通过透析法或离心浓缩装置来移除过剩的试剂，并 完 成 P B S 平 衡 生 物 素 化 IgG 的过程。 (5) 用分光光度法、B C A 法 或 B radford法测 定 Ig G 浓度（9. 2. 2 节）。 (6) 如所预期，重链-重链间二硫键被还原生成自由生物素化硫醇，而重链-轻链间二 硫键保持完整（ 图 9. 14)，则二硫键未经还原的电泳[范例流程1 7 中的步骤（6)、（7)]明显 可 见 75kDa的异源二聚体，由二硫键连接的重链和轻链组成。 生物素化山羊Ig G 时 ，应 用 T C E P 还原链间二硫键后，重链-重链间和重链-轻链间的 二硫键均被切断[7];但 Ig G 仍然保持完整且保留全部的抗原结合能力。这 表 明 IgG 在非 变性情况下，维持其构象完整和功能激活并不需要保留重链-轻链间的二硫键。但在某些 应用中，硫偶合物的功能则明显受到链间二硫键断裂的影响[16]。 9. 5 碳水化合物修饰 天然生成的抗体是N 端连接有寡聚糖的糖蛋白[23]，尽管某些单克隆抗体呈低糖基化 或完全无糖基化。由于碳水化合物修饰几乎均发生在F c 段 之 外 ，远 离 Fab段的抗原结 合位点，所 以 Ig G 的碳水化合物修饰极少影响抗原结合。当用小型附加物修饰抗体时， 这一理论上的优势同随机胺修饰相比在实际效应上通常难以被辨识。但当附加物很大 时 ，如 当 Ig G 偶联到酶或其他大分子或固相表面时一 则碳水化合物偶联会显著优于胺 偶联。而且，少数个别单克隆抗体偶尔会在靠近抗原结合位点处有特定的反应性胺，可发 生胺修饰，导致大部分Ig G 分子的失活。 N 端连接的寡聚糖是典型的复合碳水化合物，其还原末端具有唾液酸残基，所以没 有醛基暴露。但可通过下述三种方法之一人工生成醛基：用神经氨酸酶除去唾液酸(但暴 銘•的半乳糖残基的酸型与半缩酸型存在平衡，后者占有很大优势）；用 Immol/L 高碗酸納 氧化邻位唾液酸羟基；用 l 〇mm〇l/L 高碘酸钠氧化邻位其他糖链残基的羟基。正如图 9. 5 所 示 ，在轻度碱性条件下，生成的醛与氨基发生可逆反应形成席夫碱，后 者 用 N a C N _ BH3 通过弱还原剂可变得更为稳定。但这并不是一种很好的IgG 修饰方法，因 为 IgG 分 子本身也有许多氨基能够与另一个IgG 分子的醛基形成席夫碱。更为实用的方法是在
    (3) 室 温 或 4°C下 ，2000^•离心20min,沉 淀 少 量 的 不 溶 物 质 。 ( 4 ) 以 pH5. 6 的 0. lmol/L 乙酸钠缓冲液透析清亮无色的上清液，更换透析液数次。 (5) 用分光光度法定量抗体。 该 方 法 所 用 的 高 碘 酸 盐 浓 度 为 16〇 m m ol/L ，比 标 准 浓 度 高 1 6 倍 ；研 究 人 员 发 现 用 10m m 〇 l/ L 高 碘 酸 盐 在 同 样 条 件 下 氧 化 I g G 所 产 生 的 偶 合 物 每 分 子 约 带 有 两 个 D A V L B 附 加 物 。 鼠 I g G 之 一 的 I g G l 氧 化 后 完 全 丧 失 了 结 合 肿 瘤 细 胞 的 能 力 ；另 外 9 种 ，包 括 另 一 种 I g G l ，则 保 留 了 全 部 的 细 胞 结 合 能 力 。 9 . 5 . 2 范 例 流 程 11: D A V L B 酰 胼 与 氧 化 型 Ig G 的偶合 (1) 2. 76mg/ml (18. 4jLmi〇l/L)氧化型 IgG 溶液，溶于冰冷的 pH 为 5. 6 的 〇• lmol/L 乙 酸钠缓冲液中，向其中加人1/12.4体积的溶于二甲基甲酰胺的53.711^/1111(7〇 111111〇1/1^) DAVLB酰肼，应逐滴(或小量逐渐递增）加人并且持续搅拌或轻微振荡混匀；4°C 持续搅 拌或摆动式振摇24h。 ( 2 ) 室温或4°C 2000g•离心20min，沉淀少量不溶物质。 (3) 冷藏环境下，以 PBS透析上清液。 (4) 用 分 光 光 度 法 定 量 偶 合 抗 体 及 测 定 修 饰 水 平 （ 每 个 IgG 分 子 DAVLB 残 基 数 ）。 可 由 280nm 和 270nm 的 吸 光 度 比 值 来 推 算 修 饰 水 平 ，以 下 数 值 为 设 定 摩 尔 消 光 系 数 ： IgG 在 270nm 和 280nm 处 分 别 为 180 000 和 214 000;DAVLB 在 270nm 和 280nm 处 分 别 为 12 300 和 10 800。 研 究 人 员 [24]发 现 经 N a C N B H 3 还 原 的 偶 联 物 并 不 稳 定 ，虽 然 在 PH 7. 4 和 4°C (7d 损 失 了 2. 5 % D A V L B 残 基 ) 或 37°C (7d 后 损 失 1 0 % ) 条 件 下 尚 可 ，但 在 PH 5. 6 和 4°C (7d 损 失 1 8 % ) 或 37°C (7d 损 失 达 2 7 % 〜 3 0 % ，主 要 发 生 在 第 一 个 24h 内 ）条 件 下 则 不 大 稳 定 。 9. 6 抗体的固相化 9 . 6 . 1 聚 苯 乙 烯 培 养 皿 和 E L IS A 孔的固相化 许多常见的细胞和分子生物学过程，如 ELISA(范例 流 程 3)和噬菌体展示库的亲合 筛选[25]，均需要将抗体或其他蛋白质固化在聚苯乙烯表面。在这一节中，将 介 绍 4 种模 式的固相化:在塑料表面的直接非特异性吸附，通过生物素-链霉亲和素结合的固相化，通 过 F c 结合蛋白的固化(如二抗或蛋白质A 或蛋白质G) ，以及共价结合。 抗体同其他蛋白质一样，能够非特异性吸附到聚苯乙烯培养皿或ELISA孔表面，与 前文范例流程3 步骤(1)、（2)的链霉亲和素相同。蛋白质溶解于无去污剂非变性缓冲液 中，如 PBS、TBS或 0 •lm ol/L NaHCO3，浓 度 为 1〜lOjug/ml。包被的溶液与固相表面反 应 至 少 4h(过夜更佳），然后用溶于无去污剂缓冲液的高浓度无干扰蛋白质（ 如 5mg/ml BSA)封闭至少lh 。包被溶液应仅占据培养皿或孔的部分容积，但封闭液应将其充满，以 确保没有未封闭的塑料与后续反应物的接触。封闭后，彻底清洗培养皿或ELISA孔以准 备随后的固相反应。吸附蛋白质的数量取决于的反应条件,尤其是聚苯乙烯的准备;每个 ELISA孔通常为IOng—远远少于包被溶液中的蛋白质数量。长期储存或长时间反应
    弱酸性条件下与酰肼反应，此时形成的席夫碱最少（ 图 9. 2 4 ) ;生成的腙加合物在中性 PH 下十分稳定，可适于大多数应用，如果需要，还 可 用 N a C N B H 3 还原为更加稳定的替代酰 肼型，而不必还原二硫键或另行对蛋白质进行修饰（ 图 9 . 2 4 ) 。 这种偶合模式的一个重要 好处就是醛与酰肼等反应物很稳定，因此不需要现配现用。在范例流程1 0 中，结合肿瘤的鼠单克隆Ig G 被 NaIO4 氧化，在其碳水化合物部分形 成酸。范例流程 11 中，生成的活性酸 IgG• 与 I desacetylvinblastine * * 4- -3-carbohydrazide (DAVLB酰肼)反应，后者为细胞毒性长春生物碱的酰肼衍生物（ 图 9. 25)。最终生成的 共 扼 Ig G 每分子约有5 个 DAVLB附加物，是具有抗肿瘤特性的免疫毒素。两个流程的 编写均基于Laguzza及其同事关于1 0 种抗肿瘤鼠单克隆Ig G 所进行的充分研究，这 I0 种 Ig G 包括了 Ig G 的所有4 个亚型[24]9.5 .1 范 例 流 程 10:用 NaIO4 氧 化 Ig G 的碳水 化 合 物 部 分 (1) 用冰 冷 的pH5. 6 的 0. lm o l/L 乙酸钠缓冲液溶解lOmg/m l的 IgG，向其中加人 足量的粒 状 高 碘酸 钠 ，使高碘酸盐浓度达到34mg/ml(160mmol/L) ，将悬浆置于冰上不 断搅拌，旋转或轻微振荡21min。 (2) 0 〜2 °C条件下快速持续地搅拌，旋转或振荡，加 入 1/15. 7 体 积 的 12. 5m o l / L 乙 二醇(终 浓 度 800m m o l/ L ) ， 继续孵育 I h 以终止氧化反应
    时塑料应放人密封的潮湿容器内以防止干燥。非特异性吸附需要蛋白质局部变性，从而 使疏水侧链暴露给疏水的聚苯乙烯。多数情况下，这种局部变性只会使一小部分吸附的 抗体分子丧失其抗原结合能力。同样地，其他吸附蛋白质也通常在很大程度上可保留了 其功能活性。非变性去污剂，如 Tween2 0 对吸附进行封闭，在吸附过程完成后不致使吸 附 IgG(或封闭蛋白）脱 附 ；在 后 面 与 包 被 表 面 反 应 时 常 使 用 这 样 的 高 浓 度 去 污 剂 （ 如 0 . 5 % 的 Tween20)，从而阻断非特异性相互作用。 范 例 流 程 3 步骤（1)〜(4)举例说明了将生物素化IgGCBio-IgG )间接固定于链霉亲 和素包被的聚苯乙烯。如前所述，第一步，链霉亲和素包被培养皿或孔。第二步，链霉亲 和素包被的表面与Bio-IgG (或其他生物素化蛋白）在非变性条件下反应。可添加非干扰 性携带蛋白，如 B S A 和非变性去污剂，如 0. 5 % 的 T Ween2 0 缓冲液以抑制生物素化蛋白 的非特异性吸附。间 接 固 定 Ig G 具有几个优点。由于生物素化作用或与链霉亲和素包 被表面的反应均未使Ig G 变性，蛋白质在整个过程中都保持其天然形式。因为生物素-链 霉亲和素的结合具有极高的亲和力，所以只要未超过固化链霉亲和素的容量，固化过称基 本上可以量化，从而增加了可预测性以及大大减少了同直接非特异性吸附相比所需的 Ig G 数量。由于生物素-链霉亲和素相互作用的分离率极为缓慢，故即使后续暴露于高浓 度生物素（ 如 10/umol/L )时也很少使固化的Bio-Ig G 释放。少量释放的发生可能是由于 某些吸附的链霉亲和素分子发生部分变性，因为即便在高生物素浓度的溶液中生物素-链 霉亲和素复合体的分离也达不到如此的数量。在某些应用中，生物素可被加人后续的步 骤与包被的塑料表面反应，进而封闭所有空载生物素结合位点。 一些供应商提供了预先包被好蛋白质A 、蛋 白 质 G 、蛋 白 质 A /G 或 蛋 白 质 L 的聚苯 乙烯微孔板。与这些蛋白质结合的Ig G 以天然状态被表面捕获，且并未封闭它们的抗原 结合位点。选择合适的微孔板是很重要的，因为不同物种来源的不同Ig G 亚 类 对 于 4 种 Ig G 结合蛋白具有不同的亲合力。 可从一些供应商处购买到用马来酸酐(胺反应性）、马来酰亚胺（ 巯基反应性）和酰肼 (与氧化型I gG 反 应 ；见 图 9. 2 4 及范例流程1 0 和 11)预先活化的微孔板。在这些表面上 抗体的共价捕获并未使抗体变性，也极少封闭抗体的抗原结合位点。 9. 6. 2 与 亲 和介质的共价偶合 近 3 0 年来，亲和层析已经成为细胞和分子生物学的核心技术。应用抗原作固定诱饵 进行抗体亲和纯化是免疫学中最常见的应用；但与之相对，用固定抗体作诱饵亲和纯化抗 原也是很常见的。多年来，一直通过诱饵的氨基与CNBr■激活的琼脂糖微珠进行偶联，但 最近大量更具优势的另类胺反应性固相支持物可从商业途径获得。不仅包括最初CNBr 激活的琼脂糖类微珠样介质，而且也包括薄平膜片（ 如 Pall Life SdenCeS、A m i A rb 〇r 、M I 的 Immunodyne A B C 和 U ltra B in d 的改良尼龙膜）。范例流程1 2 中的亲和介质是U ltraL ink Biosupport M edium (Pierce) ，含有由亲水性交联的甲 叉双丙燦酰胺 /叮内醋 bis-acrylamide/azlactone多聚物微珠，其 直 径 为 50〜80jum，孔 径 为 lOOnm，允许通过的分子排 阻界限为2MDa。该介质比琼脂糖微珠更坚硬，可以承受的最大压强为IOOpsi;干重的溶 胀 比 为 8〜10ml/g ，基本上不依赖于缓冲液离子强度。尽管胺反应性吖内酯基团（ 图 9. 5) 摩尔数大大超过蛋白质的氨基，但其固化过程与空间位阻效应防止了单个蛋白质分子与
    更多的吖内酯基团反应。因此，抗体的固相化不大可能严重阻碍偶联分子的抗原结合 位点。 9. 6. 2. 1 范例流程 12:蛋白与 UltraLink Biosupport Medium 的偶联 (1) 浓 度 为 I.724mg/m l的蛋白质（ 确切浓度并不重要；1〜2mg/m l为较佳范围）溶 于 L o P B S (或任何其他不含亲核溶质的弱缓冲溶液）中，取 5m l与等量偶联缓冲液（ lmol/ L 柠檬酸三钠，〇.2mol/L NaHCO3，用 N a O H 将 p H 调 节 至 8. 5)混合。 (2) 取 出 40W 混合液样本加人微量离心管中，储存于冰箱待步骤（6)使 用 ；此为偶联 前蛋白质溶液。 (3) 称量 0. 625g UltraLink Biosupport Medium(Pierce;这一批次每克干重的溶胀比 为 8ml)放 人 15m l聚丙烯锥底离心管中，即刻加人其余的步骤（1)混合液，振荡使干燥的 微珠悬浮；4°C缓慢地摆动式振摇离心管过夜，使蛋白质通过氨基偶联到微珠上。 (4) 将 15m l离心管低速（ 〜lOOOr/min)离 心 5min;待下一步骤取出40W 上清液作为 样本后，离心管可置于冰箱，待步骤（6)Bradford法的测量结果。 (5) 取 40W 上清液样本加人微量离心管待下一步使用。 (6) 将 500/xl LoPBS[或步骤（1)中溶解蛋白质的任何缓冲液]与500^1偶联缓冲液 [步骤（1)]混合，置 于 1.5m l微量离心管内，制 成 Bradford稀释液。应用该稀释液，将步 骤 （2)的偶联前蛋白溶液和上一步的偶联后上清液均制成1 1 个连续对倍稀释液，方法是 用 20W 样本转移至2〇 4稀释液内。将 上 述 2 4 个样本（ 包括未稀释的偶联前蛋白溶液和 偶联后上清液）各 取 IOjul与 2504 Coomassie蛋白检测试剂（ Pierce)混 合 ，使颜色反应进 行 15〜45min，用读板机或分光光度计读取595nm 处的光密度值。结 果 实 例 如 图 9. 26 所 示 ；显然此例中大部分输人蛋白被偶联到基质上，因此未见于偶联后的上清液。 （ 因为 干介质中有紫外吸收物质，所 以 偶 联 不 能 用 分 光 光 度 计 法 测 定 ；供应商的说明书建议 BCA法可作为偶联定量的替代方法。）
    (7) 步骤（4)的 15m l反应管离心3m in(约 lOOOr/m in);小心弃去上清而不要扰动沉 淀 ；向管中加入6ml 2mol/L 乙醇胺，用 H C l将 p H 调 至 9. 0;振荡重悬基质；缓慢摆动式 振摇离心管4°C 过夜，使乙醇胺偶合，从而去除所有剩余的吖内酯反应基团。 (8) 将悬液转移至50m l离 心 管 并 充 满 TB S ;用 T B S 洗 涤 偶 联 基 质 1 0 次 ，每次约 1000r/m in 离 心 5m in 然后小心弃除上清；最后一次洗涤之后将基质重悬于45m l总容积， 4°C储存(不要冷冻）。本批次说明书给出的预期溶胀比为8,包 装 的 容 量 为 5m l。如果需 要 ，可加 入 0. 0 2 % 叠氮钠作为防腐剂（ 注意浓缩的叠氮钠毒性很高，应小心操作）。 9 . 6 . 3 经 生 物 素 介 导 与 亲 和 介 质 的 固 相 化 利用生物素-链霉亲和素结合的极高亲合力，可 将 Bio-Ig G 固化在聚苯乙烯表面，同 理 ，也 可 将 Bio-Ig G 固定于亲和介质。可购得多种形式适宜的商品化预偶联链霉亲和素 的亲和介质。这种模式的固相化极为可靠和高效，基本上所有投入的生物素化蛋白都将 被基质捕获直至超越所偶联链霉亲和素的结合能力。因此实验人员能够控制固定蛋白的 密度。为了充分利用这一优势，Bio-IgG (或其他生物素化蛋白）应分批结合到介质并充分 混 匀 ，从而使其均匀分布到介质材料上。如果违背这点建议,将数量有限的Bio-Ig G 加载 人层析柱的介质，则柱床上部蛋白质的密度会远远高于下部。 表面等离子体共振技术（ SPR; reviewed by Karlsson and Larsson[26’27])是这类亲和 介质最为常见的应用，充分展现了其优势。 SPR 设备可连续记录暴露于芯片表面l 〇〇nm 层液流的折射率指标。通常，芯片表面被覆有羧甲基葡聚糖聚合链，蛋白质或其他生物分 子可以被共价偶联到其长链上。预先偶联高密度链霉亲和素的S P R 芯片可从不同来源 的商业途径获得。 SPR 芯片被装置在整合的微流体插件内，其管道和计算机控制阀允许 泵选液体送至称为流动池的芯片表面斑钳。例 如 ， Biacore 2000 S P R 仪 （Biacore Inc.， Piscataway， NJ) ，每个芯片都有4 个独立可寻址的流动池，其容量均为60n l，当少量溶液 单独或连续地流过，设备同时可分别对全部4 个流动池进行记录。“配体”作为配对结合 的成员之一被固定在芯片表面。在下面范例流程1 3 中，配体为链霉亲和素并且预先偶联 到芯片表面。含有另一结合对成员的“分析物”溶液随后被泵入(或“注人”)流动池。此例 中 ，分析物为Bio-IgG 。当分析物分子结合到固定的配体分子上，设备以标准共振单位 (R U )精确测量并连续记录芯片表面折射率的微量增加，其数值与所结合分析物的量成 正比。由于分析物溶液连续流经芯片表面,所以结合过程并不会导致大量溶液中分析物 的浓度出现任何显著减少。 偶 联 到 S P R 芯片上的链霉亲和素是极其稳定的。在注人生物素化蛋白之前常规应 用 多 组 Im in 脉冲加样的强碱性膜漂洗液（0 •05m o l/L N aO H ,lm o l/L NaCl)清除流动池 中所有偶联链霉亲和素的外加结合物质。生物素化蛋白结合后，在多个两步结合实验中 可作为配体与另一移动分析物结合。每次两步实验后可用苛性膜漂洗液洗脱流动池的残 余分析物，而并不会释出吸附的生物素化蛋白，如果后者能够在这类膜再生液中存活的 话 。此类膜再生液主要有0. 025m o l/L H C l、p H 2. 2 的洗脱缓冲液（0. l m〇l/ L HC 1，用甘 氨 酸 将 p H 调 至 2. 2)、Pierce公司的 免 疫 纯 化 Ig G 漂洗缓冲液（ PH 2. 75)、Pie： rCe公司的 免疫纯化温和漂洗缓冲液(p H 6. 55;离子浓度极高）。 范例流程1 3 中，4 种不同的Bio-IgG被固化在含有100R U 水平的链霉亲和素偶联芯
    片 的 4 个流动池内。其 中 三 种Bio-IgG是抗多肽抗体，以复合的抗病原抗血清形式从具 有针对这三种肽以及另外上千种抗原特异性亚型的Bio-IgG总群中亲和纯化。第四个 Bio-IgG是亲和纯化中未结合的Bio-IgG群 ；因为这种吸附多肽的Bio-IgG 基本上没有任 何针对这三种肽的结合能力，在范例流程之后所描述的两步结合实验中可作为阴性对照 流动池。控 制 Bio-IgG的固化水平在这类应用中非常重要。如果固化水平太低，则在随 后的两步结合实验中不能测定分析物的结合；如果固化水平太高，则这种两步结合实验会 父到假象的影响。每 种 Bio-IgG的总消耗量少于25ng。 9. 6 . 3 . 1 范 例 流 程 13:将 B 10- I g G 固化在链霉亲和素偶联的芯片上 ( 1 ) 用 T B S /T w e e n (0. 15 m o i /L N a C l， 0. l m o l /L Tris •H C l p H 7. 5, 0. 5 % T w een 2 0 ) 以 lO p l/m i n 的 流 速 平 衡 全 部 4 个 流 动 池 。 ( 2 ) 制备每种溶于 T B S /T w e e n 的 ln m o l/L B io-IgG 稀释液 150 jlc 1;以 lO pl/m in 的流 速注入单独的流动池，连 续 监 测 R U 值的增加；当 增 加达到 I O O R U 时 ，停止注入并且将 T B S /T w e e n 泵入流动池。其中的一种 B io -I g G 注入结果如图 9 .27 A 所示。注人过程起 始 R U 值旋即会有一个急剧升高;此升高称为量移(bulk sW ft) ，反 映 出 T B S /T w e e n 缓冲 液 和 B io -I g G 稀释液总体折射率的轻微差异（ 如 果 B io -Ig G 稀 释 液 比 T B S /T w e e n 折射率 更低，则量移应为阴性）。在量移之后，R U 值逐渐增加，反映了 B io -I g G 分析物与链霉亲 和素配体的结合。生物素-链霉亲和素相互作用的简捷性使固化水平得以立即直接读取； 而更为复杂的固相化方法，如共价偶合则不能获得直接读数。 ( 3 ) 紧随累积性的增加（ 在量移之后）达 到 约 IOORU之 后 ，立即停止灌注。重启液 流 ，将 TBS/Tw een注入流动池。在一个急剧的负性量移（ 初始注入时正向量移的镜像） 之 后 R U 停留在最初基线之上的IOORU水平，表 明 Bio-Ig G 成功固化于IOORU水 平 。 (4) 对于其他三种Bio-Ig G 可重复上述步骤。 前述范例流程中制成的芯片可用于许多两步结合研究，将 固 化 的 Bio-Ig G 作为配体， 含肽的融合蛋白作为分析物。每次结合实验后，可 利 用两个Im m 脉冲的漂洗缓冲液对 芯片进行再生:如前面所提及的p H 2. 2 洗脱缓冲液，Im m unoPureIgG洗 脱 缓 冲 液 或 Im - m unoPure温和洗脱缓冲液。图 9. 27B 显示了连续8 个结合实验的结果，4 种浓度的含肽 融合蛋白被注人全部4 个流动池，持续2_ 5m in 或 lO m in，无论在注人期间（ 此时分析物与 配体结合)还是在随后的IO m in解离阶段，共振应答均被连续记录下来。每次实验后，用 两 个 Im in 脉冲的Im m unoPure温和洗脱缓冲液漂洗流动池。全 部 4 个流动池的共振应 答记录中，第四个为阴性对照，流动池的背景应答值应在其他三个流动池的应答值中减 除。图 9. 27B 显示为固化有同源抗多肽Bio-Ig G 的流动池在扣除背景后的应答值（ 其他 流动池实际上在注人时并无应答）。由于减除了背景，仅呈现出小而短暂的量移。融合蛋 白 4 种浓度下2. 5m in 和 IO m in结合阶段应答的叠加表明每次结合实验后固化Bio-IgG 的抗原结合能力均可完全恢复。这 些 SPR 实验生动地阐明了生物素介导的与亲和介质 固定的效应
    undefined7 蛋白的水解修饰 P o r t e r 发现木瓜蛋白酶可将天然兔I g G 分割为两个与抗原结合的F a b 片段以及— 个可结晶的F c 片段[28]，是将免疫球蛋白描述为四链/三域基础结构的关键。切割释放 F ab片 段 和 F c 片段发生于重链铰链区，并非因为蛋白酶对此区域的氨基酸序列具有高度 特异性，而是因为铰链区更加柔性且易于延伸，同轻链和重链的其他区域相比，更易接近 蛋白酶发生作用。其他蛋白酶同样优先切割天然I g G 的铰链区，如 图 9 . 2 8 所 示 。 因木瓜 蛋白酶切割N 端至重链-重链间二硫键的部分，其 释 放 的 F a b 和 F c 片段（ 每一个约为 5〇 kDa)彼此并无二硫键相连。切 割 的 重 链 N 端 部 分 是 F a b 片段的一部分，称 为 F d 片 段 。而胃蛋白酶在F c 段内多个位点切割C 端至重链-重链间结合的部分；因此F a b 段保 留了彼此间的二硫键，可 形 成 IOOkDa的 F (W )2 片段。 F a b 和 F (ab')2 蛋白水解片段很 容易从多克隆兔I g G 中大量分离，具有许多实际的应用。 F a b 片段与抗原单价结合，因此 避免了多价相互作用的亲和效应，而 F (a V )2 片段与抗原二价结合，从而保留了完整 IgG 的可见亲和效应。两类片段都失去了大部分涉及抗体效应功能的特异性结合位点，如补
    体的固相化。尤其是它们与许多哺乳动物细胞上的多种Fe受体均不结合，因此，在免疫细 胞化学或活体显像探针方面通常更优于完整IgG。 F(ab')2 片段重链之间的二硫键可在非 变性条件下被还原成为单价F(ab')片段，随后可被巯基反应性修饰试剂所修饰（ 9.4 节）。 ....♦ 两条重擊间二硫键 链 内 二 硫 键 : ： ： .. V A P S T C S K P T C P P P E L L G G P S V F IF P P K P K D T L M I 木瓜蛋白酶胃蛋白酶 胰i% 图 9. 2 8 兔 IgG示 意 图 [45]，原 始 免 疫 球 蛋 白 折 叠(仅 在 变 性 条 件 下 可 得)保 留 的 链 内 二 硫 键 如 图 实 线 方 括 号 所 示 ，另 一 类 二 硫 键 （ 可 在 非 变 性 条 件 下 得 到 ）如 图 虚 线 括 号 和 虚 线 （ 图 9. 1 4 普 通 IgG二 硫 键 示 意 图）所 示 。兔 IgG在 重 链 恒 定 区 极 少 有 额 外 的 链 内 二 硫 键 （ 虚 线 括 号 ）。该 图 详 细 展 示 了 重 链 铰 链 区 的 氨 基 酸 序 列 （ 基 因 库 序 列 号 P01870)，虚 线 代 表 二 硫 键 ，箭 头 所 示 为 木 瓜 蛋 白 酶 、胃 蛋 白 酶 和 胰 酶 切 割 天 然 IgG的部位[46]。 胃 蛋 白 酶 也 在 Fe功 能 区 内 多 个 位 点 进 行 切 割 （ 未 标 注 ）。 兔是哺乳动物中不寻常的仅有单一 IgG 亚型的种类；因此木瓜蛋白酶和胃蛋白酶可 以大致相同的动力学切割正常或免疫血清中绝大部分的IgG 分子。大部分其他物种具 有 多 种 IgG 亚型，被各种蛋白酶切割的动力学大为不同，取决于链间二硫键的位置以及 铰链区构造和确切氨基酸序列。表 9. 4 列举了一些对多类种属IgG 亚型蛋白质水解片段 表 9. 4 不同物种来源非变性I g G 的蛋白酶切研究 Ig G 蛋白酶 作者 人 Ig G l-Ig G 4 胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰 酶 、纤溶酶 G orevic 等[ 30] 小鼠 Ig G l, Ig G 2 a ， IgG 2b 梭菌蛋白酶、赖氨酰肽链内切酶、金属内肽酶、V 8 蛋白酶 Yam aguchi 等[ 31] 小鼠单克隆抗体OC859 胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶 Zou 等[ 32] 小 鼠 I g G 亚类 木瓜蛋白酶 A dam czyk 等[ 33] 小鼠 I g G l， Ig G 2 a ， IgG 2b 胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、胰 酶 、糜蛋白酶 P arham [34] 小鼠 I g G l， Ig G 2 a ， Ig G 2 b ， IgG 3 胃蛋白酶 L a m o y i[35] 小鼠 I g G l， Ig G 2 a ， Ig G 2 b ， IgG 3 胃蛋白酶、木瓜蛋白酶 S m ith -G ill 等[3幻 小 鼠 I g G 同种型 多种 S m ith [37] 小 鼠 Ig G l 胃蛋白酶、木瓜蛋白酶 K u rk e la 等[ 38] 小 鼠 单克隆 B72. 3 胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶 M ile n ic 等〔 39] 大 鼠 I g G 同种型 胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、V 8 蛋白酶 Rousseaux 等[4° ，41] 牛 I g G l， Ig G 2 a ， IgG 2b 胃蛋白酶、木瓜蛋白酶 B u tle r 等[42,43] 鸡 Ig Y 木瓜蛋白酶、胃蛋白酶 A k ita 和 N a k a i[44
    的研究。尽管对单一亚型均有适宜的条件，但无论在小鼠、人类还是大鼠都不存在对所有 亚型均能可靠生成F ab 或 F (ab。且产率较好的一组条件。蛋白质水解片段的制备将用 单独一组范例流程举例说明。 9. 7. 1 木 瓜 蛋 白 酶 水 解 兔 Ig G 制 备 F a b 片段 这一方法用固相木瓜蛋白酶，其优于非固相酶的主要好处是消化后切割的IgG 底物 能够从蛋白酶中完全清除，同时也能够完全清除消化前酶活化（ 半胱氨酸蛋白水解酶类） 所需的二硫化物还原试剂（ 尽管这种优势在下列范例流程中未被利用）。移除还原试剂对 兔 Ig G 尤为重要，因 其 F a b 片 段 含 有 重 链 内 二 硫 键 ，在 非 变 性 条 件 下 能 够 被 还 原 （ 图 9. 28)。木瓜蛋白酶消化的Ig G 可通过蛋白A 亲和层析柱移除F c 片段、残留的未切割Fc 片段或部分切割的IgG 。固化木瓜蛋白酶和其他酶（ 包括胃蛋白酶）可从多种来源获得。 在下面的范例流程中，固相木瓜蛋白酶是Pierce公 司 ImmunoPure F a b 制备试剂盒的一■ 部分。 9. 7. I.1 范 例 流 程 U :预试反应条件以确定木瓜蛋白酶消化兔IgG的时程 (1)将 17. 5m g 半胱氨酸盐溶于5ml Pierce试 剂 盒 中 p H 为 1 0 的憐酸盐缓冲液中。 其 p H 变 为 6. 6 ;通过加人少量2m o l/L N a O H 调 节 p H 至 6. 8 。此为消化缓冲液;保存于 冰上。 ( 2 ) 向 1.5m l微量离心管内滴人800/x l消化缓冲液。切断移液器吸头的末端使开口 处扩大。通过多次将容器颠倒混勻轻柔地将固化的木瓜蛋白酶( 6 % 偶联琼脂糖微珠形成 溶 于 5 0 % 甘油、0 •lm o l/L 乙酸钠和0. 0 5 % 叠 氮 钠 的 5 0 % 浆 液 ，pH 4. 4;每毫升固相胶体 中 含 250^g 酶;每毫克酶相当于28 B A E E 单位）彻底重悬。使用切断的吸头向1.5m l微 量离心管内滴人50W 固相木瓜蛋白酶浆液;旋振样品管5m in。在这一孵育过程中，消化 缓冲液中的半胱氨酸可还原在储存过程中被氧化的任何活性位点的半胱氨酸，从而活化 固化的木瓜蛋白酶。 (3) 样品 管 以 6000r/m in 的速度离心4m in。轻轻吸出上清液（ 小心避免损失任何沉 淀），用 SOOjuI 消化缓冲液重悬沉淀。翻转混匀，再次离心并吸出上清液。再次重悬、离心 和吸出上清液。加 入 IOOjul消化缓冲液，使表观总体积至大约150fxl。得到活化的木瓜蛋 白酶;含此内容物的微量离心管在步骤（5)和（6)中称为消化管。 ( 4 ) 向6个1.51111微量离心管内各滴人4(^12父样本缓冲液（125111111〇 1/1^： «6.8的 T ris •HC 1，2〇 %甘油，4 % 十二烷基磺酸钠，〇.4mg/m卜溴酚蓝）；这些为时效点样品管。 ( 5 ) 向消化管内的活化木瓜蛋白酶[步骤（3)]添 加 53. 7/xl (962jug)溶 于 LoP B S 的兔 Ig G ，浓 度 为 17. 9mg/m l;终 体 积 为 200/x l，终蛋白浓度为4. 7mg/m l。翻转混勻消化管中 的内容物，立即取样¥ 1 (18. 9jug)加人前一步骤中的时效点样品管之一；以 此 为 O h时间 点 。水浴温热消化管至37°C 然后将其水平贴附在37°C 摇床台面上。同时，将 Oh样品管 在 95°C 加热数分钟后储存于低温冰箱。 (6) 在 l h 、2h 、4h 、8h 和 20h ，分 别 取 出 4M1 消化管内的样本加人步骤（4)中其余的时 效点样品管。每次应尽快将主消化管放还至摇床以保证主消化反应的温度控制在37°C 。 每个时效点样品管在95°C 加 热 5m in 后 与 Oh点样本(上一步)一起储存于冰箱内。
    (7) 在 一 个 I .5m l微量离心管内混合标准品（10^1 2 X 样本缓冲液，8jnl水 ，2/^1 Promega 中 等蛋白 标准品 [Promega ， Madison， WI]) 与 Ipi 2-ME〇 (8) 解 冻 6 个时效点样品管[步骤（5)和（6)];向每管加人4〇 W 1/10 2-M E 稀释液。 (9) 将标准品与时效点样品管(前两步)在95°C 加 热 5m in ，瞬时离心使溶液和木瓜蛋 白酶树脂沉入底部。 (10) 取 21“ （ V g ) 时 效 点 样 品 管 的 上 清 液 和 5/^1标 准 品 样 本 ，进行一个标准的 12. 5 % 聚丙烯酰胺的Tris •H C l变性凝胶电泳，常规用考马斯蓝染色[29]。染色后的凝胶 如 图 9. 2 9 所示。 0 H 链 Fc\ F d - L链 ， 消化时间 /h 2 4 8 20 分子质M 标准 /kDa y 97.4 66.2 55 42.7 '40 31 21.5 14.4 图 9. 2 9 固 化 木 瓜 蛋 白 酶 消 化 兔 IgG的 时 程 。二 硫 键 还 原 后 通 过 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 分 析 消 化 后 在 不 同 时 间 点 的 IgG样 本 。详 见 范 例 流 程 14。 消化之前(Oh)完整的Ig G 呈现深染的重链（ 显见分子质量约为50kDa)和淡染的轻链 (显见分子质量约为25kDa)。消 化 I h 后 ，重链几乎完全被切成两半：深 染 的 F c 段 （ 显见 分子质量约为31kDa;天 然 F c 是这些链的同型二聚体）和淡染的F d 段 （ 很明显分子质量 约 为 27kDa) ，后者恰在轻链(其仍然保持完整，很明显分子质量约为25kDa;天 然 F a b 是 F d 与轻链的异型二聚体)之后。根据这些结果则可推知大规模的木瓜蛋白酶消化（ 范例 流 程 15)应 进 行 l h 。 9.7. 1 . 2 范 例 流 程 15:大规模木瓜蛋白酶消化兔 Ig G (1) 将 0. 25g 半胱氨酸盐酸盐溶解于71. 4ml Pierce试剂盒内PH1 0 的磷酸盐缓冲液 中。通过加入少量2mol/L N a O H 将 p H 调 节 至 6. 84。此为消化缓冲液，置于冰上。 ( 2 ) 准备一个附有15m l垂熔玻璃滤器的125m l真空瓶。通过多次上下翻转瓶子重 悬固定的木瓜蛋白酶;胶体再次沉淀前快速地向垂溶玻璃滤器内加人4m l悬液（ 澄清床 体积 约 为 2ml)。 ( 3 ) 连接真空泵吸干液体。断开真空，加 入 l 〇m l消化缓冲液，用一支宽搅棒重悬胶 体 ，重新连上真空并吸出缓冲液。如此循环两次以上。用 5ml 消化缓冲液重悬胶体；使 用转移吸液管将其全部移人预冷的50m l尖底离心管内，将烧结式玻璃滤器投人该50ml 离心管内另加消化缓冲液浴洗，使胶体悬液的总体积为12ml (体积可通过5 0 m l 管上的 刻度估算）。这便是活化的木瓜蛋白酶。 说 明 ：如前所述，兔 I g G 的链间二硫键和链内二硫键之一可以在非变性条件下被还 原（ 图 9. 2 8 中虚线括号和虚线）。由于消化缓冲液中存在半胱氨酸，所以在木瓜蛋白酶消
    化过程中可能会发生二硫物的互换。为了消除这种可能性，活化的固相木瓜蛋白酶从烧 结式玻璃滤器移出前，应经 过 p H 6. 8 的无硫醇消化缓冲液清洗数次。 ⑷ 向 活 化 的 木 瓜 蛋 白 酶 中 加 人 4. 3ml (77 mg)溶 于 LoP B S 的 浓 度 为 17. 9m g/m l 的 兔 IgG 。将盖子扣紧，轻微振荡混勻，37° c 水浴短暂温育，置 人 W C 培养箱轻摇l h 。 (5) 在 I h 的消化期间，冲洗一只15ml 烧结式玻璃滤器并且将其安装在i 2 5ml锥形 瓶上。可 用 5m l浓 度 为 lm g /m l的 B S A 冲洗滤器，以封闭滤器上的非特异性吸附，随后 用蒸馏水多次冲洗，彻底清洁过滤器。将过滤器安放在干净的125m l真空瓶上。 ( 6 ) 当 I h 的消化结束时，立即 将 5〇 m l管中的内容物转移至连接真空的15m l烧结式 玻璃滤器内，在锥瓶中收集滤出液。离 心 使 50ml 管残余的悬浮液沉人瓶底，将其并人烧 结式玻璃滤器内。断开真空，用 8ml Pierce试剂盒中的ImmunoPure IgG (A )结合缓冲液 重悬胶体，立即将洗出液也滤人真空瓶内（ 烧结式玻璃滤器内实验过的固相木瓜蛋白酶可 通过下一步骤进行再生）。将滤出液从真空瓶转移至50m l尖底尖底离心管内；另 用 5ml 结合缓冲液冲洗真空瓶，也 并 入 50m l尖底离心管的滤出液。由此得到木瓜蛋白酶的消 化 物 ，其 体 积 28m l，Ig G 浓度理论值2. 75mg/m l，在范例流程1 6 中将对其进一步处理。 (7) 再生用过的固相木瓜蛋白酶，可 用 LoP B S 清洗烧结式玻璃滤器内的介质5 次 。 将悬浮的胶体转移至15m l瓶内，总 容 积 IOm K无需精确测定)并 且 加 入 l 00y 5 %的 叠 氮 钠 。能够储存于冰箱再次使用。 9. 7. 1. 3 范 例 流 程 16:用 蛋 白 质 A 亲 和 层 析 法移 除Fc和不完全消化产物 (1) Pierce试剂盒中有两个2.5m l蛋 白 A 凝胶 柱 ，去掉两端的塞子;倒掉储存液（ 小 心 ，含有叠氮化物）；将胶柱安在环形架上；充 满 7ml Ig G 结合缓冲液至柱顶（ 见范例流程 15)开放胶柱的液体排流(液体流至柱子的烧结处的顶端时会自动停止）；另 外 用 7mi IgG 结合缓冲液冲洗柱子。 (2) 将每个柱子安放入50m l尖底离心管。用移液管向每个柱中加人半量（14m l) 的 木瓜蛋白酶消化产物[范例流程1 5 的步骤（6)];离 心 50m l管使残余消化物沉入底部，再 将其一半分别加入每个柱子。待所有的木瓜蛋白酶消化产物流入胶柱，另 加 5ml I gG 结 合缓冲液;待其流入后，再 注 入 5m l。胶柱 的 流 出 液 全 部 被 收 集 到 50m l尖底离心管内。 每管的终体积应为24m l。将一个尖底离心管的内容物转移至另一个管中。是为总体积 45m l的 Fab，理论上浓度为I .14mg/m l;在下面步骤（6)处理之前储存于冰箱内。 (3) 每个蛋白A 柱使用完毕后，架放在废液杯上。用 3ml Ig G 结合缓冲液冲洗柱子 2 次 ，流出液体收集在废液杯里。然后将胶柱放入在装有300|ul p H 9. 1 的 lm o l/L T ris • H C l的 15m l聚丙烯管内。用 Pierce试剂盒内免疫纯化I gG 漂洗缓冲液I m l流洗每个胶 柱 6 次。将两个柱的洗出液汇集放人1 个 带 盖 的 15m l 瓶内，净 重 为 13.6 g = 13.6 ml。 F e 浓度理论值为1.89mg/m l;洗脱液中也可能存在一些切割不完全的污染物。用试纸估 算 p H 约 为 8. 4 。试剂瓶应冷冻储存。 (4) 为了再生胶柱，可将每个柱子稳放在大废液杯中，用 以 N a O H 调 p H 至 3 . 0 的 0 •lm o l/L 柠 檬 酸 5m l冲 洗 2 次 ，再 用 5m l蒸馏水冲洗2 次 ，最 后 用 7m l含 0.02% 叠氮钠 的水冲洗1 次 。当柱床顶部剩有2m l液体时关闭柱流。首先安上底部塞子，然后再安上 顶部塞子。将柱胶储存于冰箱内。
    ( 5 ) 如沮例流程1 4 步骤 （ 7) ，在一 个 I. 5m l微量离心管内混合标准品。预 混 585pi 水 、650/il 2 X 样本缓冲液和65M1 2-M E ;向 两 个 1.5m l微量离心管内分别加入6〇 4该预 混液;其中一管(Fab)加 入 3jul (理论值为3.42Mg)步骤（ 2 )制 备 的 Fab;另一 管 （ Fe)加人 > 1 (理论值为I .8^ g)步骤（3)制备的Fc。将样本在沸水浴中加热5m in ;冷 却 ；瞬时离心 使样本沉入管底。如范例流程I4 步骤（ 1〇) ，取 214 Fab、21fzl F e样 本 以 及 5/^1标准品进 行电泳。结果如图9. 3 0 所示，基本上被木瓜蛋白酶完全消化（ 如 范 例流程1 4 中的时程实 验)并且F a b 片段和F e 片段得到完全分离。 分子质S 标准 Fab Fe /kDa ^ 97.4 66.2 _ H H M P 一 ^ 42.7 獨 圓 # ^ ^ 40 Fd、 寒 " 丨 _ — 31 L链， —21.5 m m ~ 14.4 图 9. 3 0 通过蛋白质A 层析所得到的Fab和 Fe样本，当二硫键被还原后由丙烯酰胺凝胶电泳 进行分析。详见范例流程16。数据显示Fab片段并无Fe段污染物。 (6)浓缩步骤（2)制备的大体积F a b 片段，用 LoPBS在 30k D a 离心浓缩装置的离心 超滤管内将其冲洗2 次;终体积为I .935m l。通过分光光度计扫描1/40稀释液测得蛋白 质浓度为24mg/m l，假 定 lm g /m l溶液的吸光度值为I .482，则 总 产 量 为 46m g，理论上达 到了 77mg Ig G 输 人 的 9 0 % 。 由于在木瓜蛋白酶消化过程中可能会发生二硫互换反应[范例流程I 5 步 骤 （3)标 注 ]，所 以 F ab 可带有一些自由巯基。在范例流程1 7 中，任何这样的巯基都可用] V-ethylmaleimide (N E M ;图 9. 22)通过烷基化作用所封闭。 F a b 产物随后可由葡聚糖G 150通 过 凝 胶 过 滤 层 析 进 行 分 离 ，以 明 确 区 分 F a b 分 子 （50 kDa ) 与 杂 质 ，如 F a b 二聚体 (100 kDa)、部分切割的IgGGOO kDa)或 未 切 割 的 IgG (150 kDa)等 。结果表明，在此例 中可能并不需要进行层析，因为未见杂质。 9. 7. 1. 4 范 例 流 程 17:用 N-ethylmaleimide封闭巯基及 葡 聚糖G1 5 0 色谱 (1) 将 IO g 葡 聚 糖 G150在 80°C 水 中 溶 胀 5h ，冷却，通过三次循环沉淀移除细碎杂 质 ，用 LoPBS平 衡 ，然后将其灌人内径2. 5c m 的层析柱，栗 速 为 l ml/m in 填 压 。最终柱 床高度为45cm，相应的体积为220m l。 (2) 65/xl LoPBS 和 9. 2/^1 250m m ol/L 的 E D T A ，用 NaOH 将 pH 调节至 8,然后加 入 F a b 产物[范例流程1 6 步骤（6)];加 入 E D T A 的目的是螯合重金属离子，后者可催化 巯基的氧化反应。 ( 3 ) 将 小 量 N E M 溶 于 足 量 H E P E S 缓冲 液 （ l 〇〇mrn〇l/ L HEPES，用 N a O H 将 pH 调 节 至 7. 0 ) ，制 成 2. 5m g/m l (4〇mmol/L ) 溶 液 ；向 上 一 步 F a b 产 物 内 加 人 670pl
    40mmol/L NEM ，使 NEM 终 浓 度 为 10mmol/L;室温孵育40min， N EM 可烷基化任 何 自 由巯基。需 注 意 NEM 有毒，应恰当处理其废弃物。 ， ( 4 ) 立 即 将 N E M 处 理 的 F ab 产 物 装 入G150柱 内 ，用 LoP B S 以 lm l/m in 的流速洗 柱 ，分段收集3. 9m l和 I .9m l。 (5) 测 定 收 集 物 在 280n m 处 的 吸 光 度 值 ，结 果 如 图 9. 3 1 下 部 所 示 .在 预 期 出 现 50kDa F a b 片 段 的 位 置 可 见 单 一 对 称 的 蛋 白 质 峰 ；未 见 明 显 的 15〇 k D a 完 整 Ig G 或 IOOkDa部分消化产物的痕迹。 ( 6 ) 预 混 585fxl水 和 65〇 M 2 X 样本缓冲液[范例流程1 4 步骤（4)]，分 别 取 1 9 4 预混 液 加 入 1 6 个 I.5m l微量离心管；向这些微量离心管中加人2^x1 步 骤 （4)所收集的部分。 向另外两个I.5m l微量离心管内加入385jul和44沁预混液;再向这些微量离心管内各加 人 1^1 (17. 9jug)未处理的IgG 和 I.l/xl (理 论 值 2. 片段[范例流程1 6 步骤（ 3)]。 95°C加热全部1 8 个微量离心管5min;瞬时离心使液体沉人管底。这种电泳样本不 含 巯 基乙醇或其他还原试剂，因而所有二硫键均应保持完整。 ( 7 ) 将前一步骤的样本分在两块T ris. H C l丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并用范例流 程 I 4 步骤（ 10)的方法染色凝胶，结 果 如 图 9. 3 1 上部所示。所有片段的主要种类其分子 质 量 均 为 明 显 的 50kDa， 如 预 期 的 F a b 片 段 ，其 轻 链 和 F d 段 仍 然 由 二 硫 键 彼 此 相 连 (图 9. 28) 。图 9. 3 1 分析G150凝胶过滤的片段，详见范例流程17。图的下部显示为G150片段的蛋白质浓度；大 的实心正方形为最终收集的纯化Fab片段；小的实心圆形为丢弃的片段。图的上部显示为丙烯酰胺凝 胶电泳分析G150片段，并未还原二硫键。几乎所有蛋白质均为二硫化物结合的50kDa大小。 注 ：F c 片段大约是25kDa、50kDa和 75kDa分子质量的几个不同种类 片 段 的 混 合 ，分 别对应于重链F c 段的单体、同源二聚体和同源三聚体（ 图 9. 28) 。 在木瓜蛋白酶消化过 程中由于二硫互换反应可引起这种多聚体状态的异质性[范例流程1 5 步骤（3)的注释]。 •176 •
    但 是 ，由于在非变性条件下重链F e 部分理论上仅有一个半胱氨酸基团（ 图 9. 28)可接近， 因此不能形成三聚体。或许在步骤（6)变性后可发生二硫互换反应；此 外 ，三聚体的形成 可见于一些重链N 端至首个半胱氨酸部分被木瓜蛋白酶切除，详 见 图 9. 28,而不是被切 割在首个半胱氨酸由二硫键连接另一重链的半胱氨酸。 ( 8 ) 汇 集 第 4 步所获的峰值部分（ 图 9. 3 1 下部大的实心正方形所示）；在 30k D a 离心 浓缩装置的离心超滤管内浓缩并且用L o P B S 清 洗 两 次 （9. 2 . 3 节 ）；终 体 积 为 1.445m l。 可将制品储存于冰箱或冻存。 (9) 用分光光度计扫描1/40稀释液。按照前一范例流程步骤（6)的方法推算其浓度 为 24. 4mg/m l。因此总产量是1. 445 X 24. 4 = 32. 3m g，为 起 始 77mg Ig G 应得理论产 量 的 6 9 % 。 9. 8 抗体与其他蛋白质的交联 抗体与其他蛋白质共价交联的免疫结合方式已经广泛应用于当今的生物技术中。最 主要的此类交联物包括应用于E L IS A 、免疫印记和免疫细胞化学的抗体与免疫毒素的偶 联 物 ，其将针对肿瘤或其他治疗靶标特异性的抗体与细胞毒“有效载荷”连接起来进而杀 灭目标。 Hermansonw 已经总结了酶结合和免疫毒素的制备；在此仅讨论和说明最普遍 的原则。 现今几乎所有抗体-蛋白质结合均应用异双功能交联剂的两步法来完成。双方（ 抗体 和其他蛋白质）均经过相对稳定的反应基团而被修饰“活化”。混合两个激活的蛋白质使 彼此交联。两步交联主要适于两方彼此交联生成功能复合体，而不是自身的交联形成无 功能蛋白质或产生干扰性的多聚物。有效的两步交联法关键在于三个基本特征：①交联 化学应有“正交性”，意指结合到一种蛋白质的激活基团不应与该蛋白质的任何基团反应， 但应易于同结合到另一蛋白质的激活基团反应；②活化基团应该是稳定的，能够留出足够 时间使得两个激活的蛋白质在彼此交联前被纯化和定量；③活化基团应可以定量，能够实 现交联反应的调控与可重复。 某些例子中的马来酰亚胺/硫醇反应系统（ 图 9. 2 2 下部）相当好地满足了这些标准。 例如，保护性硫醇可以用胺反应性N H S 醋 S A T A (范 例 流 程 5)与抗体（ 少有或没有内源 性自由巯基）结 合 ，而 马 来 酰 亚 胺 能 够 用 胺 反 应 性 N H S 酯 succinimidyl-4-(iV-maleimidomethyl) cyclohexane-l -carboxyiate(SMCC)与其他蛋白质结合。另夕卜，将马来酰亚月安 结合到抗体的氨基上，而其他蛋白质的氨基可以被硫醇化（ 若其本身不含内源性自由巯 基）。 自由巯基尽管易受空气氧化的影响，但对于一个短暂的纯化过程而言仍然足够稳 定 ，并且很容易用EUm an氏试剂（ 范例流程8)进行定量。马来酰亚胺虽然可发生慢性水 解 ，对于纯化过程而言已是足够稳定了（9. 4.4节）；然而其有不易定量的缺点。 Solulink(San Diego, C A )最近提出了一种醒/肼交联技术，称 为 H ydraLinK ,同马来 酰亚胺/硫醇系统相比，它更充分满足了正交性、稳定性和可定量性的需求。如 图 9. 3 2 所 示 ，Ig G 的氨基与S A N H 反 应 形 成 M E H N -Ig G 加合 物 ，封闭有丙酮的芳香肼；而其他蛋 白质的氨基与S FB 反应形成FB-蛋白质加合物，具有芳香醛。胺修饰的蛋白质在水溶液 中可以稳定数周—有大量时间进行定量和纯化。当两者被混合后，一个蛋白质上的芳
    图 9. 32 IgG与另一蛋白质的H ydraLinK交联。两个蛋白质之一（ 此 例 中 的 IgG)，在 中 性 PH 条件下 用 N H S 酷 acetone 5-(succinimidyloxycarbonyl)-pyridine~2-yl hydrazone(SA N H )对其进行胺修饰，产生 了 6 -[2-(l-m ethyethylidene) hydrazino]nicotinyl-(M EH N -)IgG 加 合 物 ，具 有 一 些 丙 酮 封 闭 的 芳 香 肼 。 相应地，另一个蛋白质（ 也 在 中 性 p H 条件下）用另一 N H S 醋 succinimidyl 4-form ylbenzoate(SFB)进行 胺 修 饰 ，生 成 form ylbenzoyl-(FB-)蛋白质加合物，具有一些芳香酸。当两种修饰蛋白混合后，一个蛋白 质的芳香醛取代了另一蛋白质芳香肼的丙酮封闭基团，通过稳定的双芳香腙连接将蛋白质交联起来。 香 醛 迅 速 取 代 了 另 一 个 蛋 白 质 上 芳 香 肼 中 的 丙 酮 ，因 此 通 过 稳 定 的 双 芳 香 腙 (H ydraLinK )将两个蛋白质交联起来。不同于非芳香腙（ 图 9. 24)，这些连接在非常广的 p H 范围内都是稳定的，不会被还原。当两个蛋白质成功交联后，任何未反应的醛均能够 被过量芳香肼所封闭，任何未反应的肼均能够被过量芳香醛所封闭（ 图 9.33)。这类封闭 反应也形成了近紫外的呈色基团，进而在交联前通过位于修饰蛋白上一小部分数量的肼 或醇来进行定量（ 图 9. 33)。范 例 流 程 18〜2 0 以 Novabiochem(San Diego， C A ) 的说明 书为基础，讲解了肼修饰Ig G 与醛修饰其他蛋白质的过程;顺序是可以完全颠倒的。 9. 8. 1 范 例 流 程 1 8 : 胼 与 I g G 氨 基的交联 (I ) IgG 溶于 PBS 使其浓度为 50jum ol/L (0. 15m o l/L NaC l，0. lm o l/L N aH 2PO4, 用 N a O H 将 p H 调 节 至 7. 2)。将 固 体 S A N H (图 9. 32)溶于足量的二甲基甲酰胺，浓度 为 I .45m g/m l (5mmol/L )。向 1 0 倍 体 积 的 50p m o l/L Ig G 溶 液 中 加 入 1 倍体积的 5m m ol/L S A N H 5IgG 和 SAN H 的终浓度分别为 45. 5|Ltmol/L 和 455jumol/L 。室温下反 应 至 少 2〜3h 。 注:Novabiochem的说明书推荐每个M E H N -Ig G 分子的修饰水平m 为 2. 5〜3 个肼 (范例流程18)，每 个 FB-蛋白质分子的修饰水平m 为 2. 5〜3 个醛(范例流程19)，但并未
    给出可获得此等可靠的修饰水平(相当于图9. 7 中）的具体指导。因此为得到适宜的修饰 水平，可能需要进行细致的试验研究，反复摸索。 (2) 消 除 M EHN -IgG结合物中的未结合肼，用乙酸盐交联缓冲液通过透析或离心浓 缩装置重新平衡（9. 2.2节）。 关于交联缓冲液的注释:交联反应（ 范 例 流 程 2 0 ) 的 最 佳 p H 为 4. 7,在 范 例 流 程 20 中 使 用 乙 酸 盐 交 联 缓 冲 液 （ O. l m o l / L 乙酸 钠 ，用 H C l将 p H 调 节 至 4. 75)。虽然在 PH 4. 7 5 的条件下，抗体通常并非不可逆性的去活，但很可能抗体所偶联的另一蛋白质并 不能经受如此的p H 。范例流程2 0 中 ，仅能选择较弱的酸性交联缓冲液，相应延长交联 的时间。其他的交联缓冲液，如 0. 15m o l/L N aC l，0. l m o l / L 柠 檬 酸 ，用 N a O H 将 p H 调 节至 6. 0;p H 7. 2 的 PBS。 ( 3 ) 用 B r a d fo r d 或 B C A 法 测 定 M E H N - I g G 结合物的浓度（ 见抗体的定量；芳香酰 肼附加物会干扰分光光度计测定）。 ( 4 ) 少 量 的 M E H N -I g G 结合物与过量p-nitrobenzaldehyde(P N B A )反应可通过比色 法测定修饰水平m (每 个 I g G 分子的肼的数目），如 图 9. 3 3 所 示 。将 数 毫 克 P N B A 溶于 D M S O 中，使浓度为 7. 56m g /m l(50m m o l/ L ) 。 将 1 倍 体 积 的 50m m o l/L P N B A 稀释于图 9. 3 3 修饰蛋白的定量和封闭。为 了 对 F B -蛋白质结合物的醛进行定量，少 量 修 饰 蛋 白 与 过 量 2-肼 B 比陡（2-hydrazinopyridine)反 应 ，产生 了 封 闭 酸 的 加 合 物 ，其 在 350n m 处 吸 收 光 。同样地，为 了 对 ME H N -Ig G 加合物的肼进行定量，少 量 修 饰 的 I g G 与 过 量 p-nitrobenzaldehyde反 应 ，产生了封闭酰肼的加 合 物 ，其 在 390nm 处吸收光。当 F B 蛋 白 和 M E H N -I g G 混合后，使蛋白质与蛋白质交联，未反应的醛能 够 被 过 量 2-肼吡啶所封闭（ 使其不能反应），此后未反应的肼能够被过量2-sulfobenzaldehyde所封闭。
    100倍体积的乙酸盐交联缓冲液[步骤(2)之后的注释；即使范例流程2 0 的交联在其他较 弱酸性缓冲液中进行，仍可用乙酸盐缓冲液进行定量]，配 制 SOOjumol/L P N B A 稀释液。 将 1 倍体积的SOO^m o i/L P N B A 与至多0 •2 5 倍体积的M EH N -IgG结合物混合，生成的 Ig G 样 本 其 Ig G 终浓度为7|； m iol/L ，PN BA 终浓度至少为400/ianol/L ;作为 对 照 ，将 1 倍 体 积 的 SOO^rn o l/L P N B A 与等体积的空白缓冲液[同步骤(2)用于平衡Ig G 的缓冲液]混 合 。 IgG 样本和对照均应该有足够的终体积装满分光光度计的比色杯，且 p H 不应高于 5 。两种混合液经37°C 孵 育 I h 或室温孵育2h ，然 后 在 380n m 处测定其吸光度值。修饰 水平的推算方法为m = 如步骤（1)之后的注释，建议每个蛋白质 0. OZZ X / 分子的修饰水平为2. 5〜3 个肼。 9 . 8 . 2 范 例 流 程 1 9 : 醛 与 另 一 个蛋白 质 氨 基 的 交 联 (1) 将另一个蛋白质（ 偶 联 到 Ig G 上的蛋白质）溶 于 P B S 中 使 浓 度 为 SO^mol/L 。 S F B 固体（ 图 9. 32)溶于足量的二甲基甲酰胺使浓度为I .24mg/m l(5mm〇l/L )。将 1 倍 体 积 的 5m m ol/L SFB 加 入 1 0 倍体积的50ym ol/L 蛋白质溶液中；蛋 白 质 和 S F B 的终浓 度分别为45. 5jumol/L 和 455/m iol/L 。反应在室温下至少进行2〜3h [见 范 例 流 程 1 8 步 骤 （1)后的注释]。 (2) 清 除 FB-蛋白质结合物中的未结合醛，用乙酸盐交联缓冲液[见范例流程1 8 步骤 (2)后注释]通过透析或离心浓缩装置重新平衡。 (3) 用 B radford或 B C A 法 测 定 FB-蛋白质结合物的浓度(芳香醛附加物会干扰分光 光度计测定）。 ⑷ 少 量 FB-蛋白质结合物与过量2-hydrazinopyridine(H P )反应可通过比色法测定 修饰水平m (每个蛋白质分子的醛的数目），如 图 9. 3 3 所 示 。将 数 毫 克 2-hydrazinopyridine • 2HC1 溶 于 水 使 其 成 为 9. lm g /m l (50mmol/L )浓 度 的 H P 溶 液 。将 1 倍体积的 50m m ol/L H P 稀 释 于 100倍体积的乙酸盐交联缓冲液中[见范例流程1 8 步骤(2)之后的 注释；即使范例流程2 0 的交联在其他较弱酸性缓冲液中进行，仍然可以用乙酸盐缓冲液 来定量]，制 成 50(V m o l/L H P 稀释液。将 1 倍 体 积 的 50(V m o l/L H P 与 至 多 0. 2 5 倍体 积 的 FB-蛋白质结合物混合，产生的蛋白质样本其蛋白质终浓度为7ym ol/L ，H P 终浓度 至 少 为 400^mol/L ;作为对照，将 1 倍体积的SOOjumol/L H P 与等体积的空白缓冲液[与 步骤(2)用于平衡蛋白的缓冲液相同]混合。蛋白质样本和对照均应该有足够的终体积充 满分光光度计的比色杯，且 p H 不 应 高 于 5。两 种 混 合 液 经 过 37°C 孵 育 I h 或室温孵育 2h ，然后测定350n m 处吸光度值。修饰水平推算式为m = ) 二 (A 350对照） 。 如 U. O lo X I 范例流程1 8 步骤（1)后面的注释，建议每个蛋白质分子的修饰水平为2. 5〜3 个醛。 显然，只有当蛋白质具有足够易接近的氨基时，才能进行范例流程1 9 的操作。辣根 过氧化物酶是E L IS A 、免疫细胞化学和免疫印迹中最常用的抗体交联酶，其与众不同之 处是每分子仅有2 个可用的e-氨基组。另外,辣根过氧化物酶含有丰富的碳水化合物，易 于用高碘酸盐氧化为醛（9. 5 节） • ，而高碘酸盐氧化的辣根过氧化物酶已经商品化。高碘
    酸盐氧化的辣根过氧化物酶可替换范例流程2 0 交 联 反 应 中 的 HP-蛋白质结合物。尽管 后来的交联反应并非双芳香HydraLinK的连接，不过仍然足够稳定，所以无须再用氰基 硼氢化钠还原加强稳定性。 在范例流程2 0 中，将 MEHN-IgG和 FB-蛋白质结合物混合，以 HydraLinK连接实 现交联（ 图 9. 32)。交联反应尚无普遍适用的指南，不 过 Novabiochem的使用说明中报告 了 FB-IgG(相对分子质量150 000)与 MEHN-BSA(相对分子质量66 000)以不同比率进 行交联的试验性示例结果(非完整记述）。当 B SA 与 IgG 的 摩 尔比为3 : 1 时 ，全 部 IgG 和大部分B SA 可形成交联复合体。在可用的肼和醛完全反应之前很久就可能由于空间 位阻而导致交联剧减或完全停止。出于同样原因，交联程度主要取决于两种反应物的比 率 ，其次是它们各自的浓度。总之，可以应用过量的H P 封 闭 FB-蛋白质结合物上未反应 的醒，以及用过量2-sulfobenzaldehyde(SBA)封 闭 MEHN-IgG结合物上未反应的肼，如 图 9. 3 3 和范例流程2 0 所示。封闭可抑制任何进一步的交联反应。 9 . 8 . 3 范 例 流 程 2 0 : M E H N -I g G 与 F B -蛋 白 质 的 交 联 ( 1 ) 将 M EH N -IgG和 FB-蛋白质交联物以适当的摩尔比混合于交联缓冲液中[范例 流 程 1 8 步骤（2)注释]，室温反应1〜3h(如偶联缓冲液的p H 为 7. 2,则反应至少6h) 。 ( 2 ) 向 100倍体积的前一步骤的交联反应混合液中加人1 倍 体 积 的 50mmol/L HP [范例流程19步骤(4)]，^^的终浓度为500^111〇1/]_封 闭 反 应 室 温 持 续 迚 。 (3) 苯甲醛-2-磺酸钠溶于水制成浓度为10. 4m g/m l (50mmol/L )的 S B A 溶液。向 5 0 倍体积的前一步骤的反应混合液中加人1 倍 体 积 的 50m m ol/L S B A ，S B A 终浓度为 lm m o l/L (为上一步骤H P 摩尔浓度的两倍）。封 闭 反 应 在 室 温 持 续 I h ;孵 育 过 程 中 ， S B A 不仅封闭M E H N -Ig G 结合物上未曾反应的肼，也与前一步骤过量未反应的H P 发 生反应。 注 ：这两步封闭反应必须按顺序完成，不能同时进行;否则，封闭反应物之一(过量者） 会使另一反应物在封闭完成之前就已失活。 ( 4 ) 释放过量封闭反应物的交联蛋白，通过透析或离心浓缩装置用需要的终缓冲液 进行平衡。 (5) 通 过 SDS-P A G E 以及所需的功能实验鉴定交联复合体。倘 若 I gG 能够有效地 结合到镍螯合物上(“固相生物素化反应”），如果需要，可以通过镍金属螯合亲和层析法使 交联复合体释放未交联到IgG 上的蛋白质。 致 谢 ：本章由美国国家卫生研究院资助作者的GM41478基金以及美国国家癌症研 究 院 资 助 W y n n A . Volkert的 P50-CA-10313-01基金支持。感 谢 Robert Davis在本章 所涉及的许多实验工作中给予了大量的技术协助。

    来源：丁香实验

    提问
    扫一扫
    丁香实验小程序二维码
    实验小助手
    丁香实验公众号二维码
    扫码领资料
    反馈
    TOP
    打开小程序