图16-5显示了开始一项新实验应用前的做决定的流程图。首先要根据记录的需要决定使用哪一类指示剂：记录膜电位用VSD,记录钙离子浓度用CaSD,记录其他离子浓度则用与之相应的离子敏感的指示剂，然后就要选定具体的指示剂。对于VSD要考虑以下几点：选用光吸收性的还是荧光性的指示剂；所希望的指示剂的光谱特性（根据能得到的滤光片、光源和组织特性如自发荧光来决定）；对不同样本装载染料的不同而带来的实验次数和误差。对离子敏感性染料而言，必须要考虑实验中所需的染料的亲和性、与离子结合的动力学特性。还要考虑的是用选择性地对特定组织结构注入染料，还是用浸浴的方法；尽管在 电压敏感染料 这一部分中还提到其他方法，但VSD通常只用浸浴的方法，下一步就要选择显微镜（直立式或倒置式）和物镜的种类。

不同构造的显微镜的优缺点已经讨论过了。对物镜镜头来说，应主要考虑其种类（对倒置显微镜是空气镜或油镜，对直立显微镜是水镜)、希望的放大倍数和数值孔径，以及工作距离。滤光片的选择应该根据指示剂的特性来确定。最后就要选择检测器的种类。在做最后决定前应仔细考虑上述讨论过的所有的问题。还有，我们强烈推荐先用一个单光电二极管来测试计划中实验的稳定性，包括要装载的指示剂的量、信号的大小、到达检测器的光强（细节请看 故障修理 部分)。下面，我们给出经过上述考虑过程做出最终决定后的几个光学记录的具体例子。

材料

步骤

一、海马区脑片样本的制备

下面简单介绍我们实验室中制备海马区横断切片的操作程序；然而，任何其他方法只要能使脑片存活，都是可行的。合适的染色液应该在切脑片前就准备好。

1.用甲氧氟焼（methoxyflurane)麻醉动物，并用铡刀将其快速断头。

2.将取脑立即放到冰浴溶液中冷却3~5min。

3.从脑中分离出海马区。

4.把海马区放到振动切片机上（Vibratome1000,TPI),从海马中部1/3处切出厚度为 4OOum 的脑片。

5.染色前把脑片浸在室温的浸浴溶液中，但是如果用CaSD浸浴染色就要把脑片马上放到染色液中。

二、载入染料

载入VSD

载入CaSD

三、光学记录操作步骤

下面我们要介绍的是，运用上面提到的各种实验设计，记录装好染料的脑片的诱发或自发信号的操作程序。抛开具体的实验细节不讲，对任何光学记录实验，有几件事是必须要做的。首先，要测量组织的自发荧光；如前所述，当使用的指示剂需要用短波长光来激发时，这尤其重要。在向脑片的特定组织中选择性地注入CaSD到轴突束时，可以在同一脑片上未注入染料、与记录区相类似的区域记录其自发荧光，或者在注入染料前测定记录区本身的自发荧光，以便对信号进行校正。在用浸浴法往脑片中载入染料的情况下，可以记录同一动物另一上相应区域的自发荧光。照明光强度在测量自发荧光和实际记录中保持不变是至关重要的。

另外一件在每次实验中都要做的事是要记录光漂白。在光照过程中光学指示剂分子会被漂白，也就是说，它们发出的荧光会消减。我们不可能知道这些分子实际上是被漂白了还是被捕获而暂时不发荧光。如果不考虑其精确机制，光漂白是一个单指数函数的过程，因此很容易对其进行补偿校正。校正光漂白最简单的方法是，在没有任何活动(既没有诱发活动也没有自发活动）的情况下，记录一段时间。这段时间里各参数(A/D转换速度、记录时间、快门打开时间）都应该和实际采集数据时一样。另外一种方法是，因为光漂白是一个单指数函数过程，如果在实际记录前把快门打开足够长的时间，那么在记录时，光漂白就会接近稳态。后一种方法在记录自发活动时很有用。

单光电二极管记录诱发活动

用单光电二极管记录诱发活动时，其记录的步骤相对直接—我们通常使用油浸物镜(Achroplan50倍，数值孔径为0.9，Zeiss)。我们使用一块多用途卡（12-bit,50kHz，DAS-50,Keithley)来对数据进行模数转换并提供数字信号线来控制快门和电刺激器。从传统的用来记录细胞外场电位的微电极出来的信号以及从单光电二极管出来的信号都通过这块卡转换成数字信号。图16-7显示了一个典型的实验所涉及的步骤。首先要测定适当的自发荧光。

用PDM记录诱发活动

用光电二极管阵列记录诱发反应，我们通常使用一个10倍和数值孔径为〇.5的物镜（Zeiss)。我们使用一■块多用途I/O卡（Flash12，StrawberryTree)来对数据进行A/D转换并提供数字信号线来控制PDM放大器、快门和电刺激器.这块卡上的A/D转换器有8通道、12bit、400kHz、256k的采样在位记忆；它还有8条TTL输入/输出(I/O)线和一个两通道的A/D转换器。从传统的用来记录胞外场电位的微电极出来的信号被输进PDM放大器并与图16-4中显示的所有光学通道相连。图16-8显示了一个典型的实验有关的步骤。由于上面已经讨论过的原因，分开进行AC和DC测量是必需的。因为我们通常和PDM配套使用的指示剂是用长波长光来激发的，这种情况下自发荧光对信号的影响比放大器造成的偏差要小得多，所以不必对自发荧光进行校正。

用PDM记录自发活动

用PDM记录自发活动所需的硬件和基本操作程序与用PDM记录诱发活动相似。主要的难点在于缺乏一个事件来触发数据采集。通常用于微电极记录自发活动的连续记录的方法，因为数据量过大（>1〇〇通道)，通常不予使用。我们使用两种方法来用PDM记录自发活动。第一种方法使用软件获得自发活动的概率（Coiom and saggau 1994;Sinha et aL1995):采集和显示事先确定长度的一段数据；当研究者看到一件感兴趣的事件时，停止采集数据并保存最后的一段数据。这种方法适合于记录相对频繁的事件，例如，频率大于0.2Hz的；然而，这种方法难以可靠地记录发生频率更低的事件。

对这种方法进行一些小改进可以使它能可靠地记录发生频率低于0.05Hz的事件。图16-9显示了改进方法的流程图。采集一段数据（通常0.5~1s),只有电信号通道;^分离输出并显示。这个过程一直重复直到研究者观察到自发活动并触发计算机；触发前被采集的打段数据（通常2~3段）被分离输出、显示，还可以被进一步的处理和储存。

四、光学记录数据的处理

光学记录数据处理的第一步是校正自发荧光和仪器造成的偏差。对单个光电二极管而言，只要简单地从所有光学记录的数据点上减去这些偏差就可以了；对PDM来说,要从代表静态荧光的直流荧光中减去这些偏差。所有的光学信号都要以荧光变化强度除以静息时的荧光强度（AF/F)来表示。这种表示方法有助于消除染料浓度、照明光强和光检测器各元件对光敏感度不同带来的偏差。对单光电二极管而言，静息时的荧光(F)是数据记录中观察到任何活动之前，尤其是刺激开始之前的那部分数据的简单平均值;在记录过程中把每个数据点的F相减就得到荧光变化F。对PDM来说，直流荧光表示静息荧光，而交流荧光则代表荧光变化（AF)。对CaSD而言，AFAF的增加代表[Ca²⁺]i的增加。对VSD而言，AF/F下降意味着去极化;所以，所有的VSD数据都要翻转，使得去极化相对应于向上的偏转。

对两种检测器而言，校正光漂白的方法是:首先计算纪录数据和光漂白数据的AFAP，然后对单光电二极管的每个数据点，用记录数据AiVF点对点地减去光漂白数据AF/F;对PDM数据，则要对每个元件都要进行这种相减的校正。

我们用两个不同的量来对光学信号进行量化。对VSD和CaSD都可以使用怡号幅度。对单独的VSD，平均窗口宽度（mean window amplitude, MWA)(Albowitz, Kuhnt 1995)也是一个有用的量。简单地说，MWA就是在一段给定的时间窗口内VSD信号的平均值。与信号幅度不同，MWA反映了一段活动的变化以及其最大幅度。另外，对小信号而言，它的另一个好处是减少了噪声的影响：在计算这个时间平均值时，噪声时程要短于计算MWA的时程，因此就降低噪声成分的影响.很重要的一点，就是计算CaSD信号的MWA是没有意义的，因为CaSD信号要受到指示剂的动力学影响，还要受到钙离子浓度的瞬时变化影响。对CaSD信号有用的量是信号的一阶导数：如果CaSD信号与[Ca2+］i成比例，并且从胞内钙库释放的钙离子显著不多，那么导数应该与流进的钙离子成比例。另外，如果使用具有快速动力学特性的染料，特别是那些对钙离子亲和力小的染料，那么这个导数的持续时间大致与轉离子内流时间相当（Sinhaetal.1997)。

结果

通过上面的技术介绍，我们可以对海马脑片进行各方面的研究，包括突触传递、递质释放的调制、可塑性和癫痼样的活动（WuandSaggau1994a,b,1995,1997;QianandSaggau1997a,b;ColomandSaggau1994;Sinhaetal.1995,1997)〇下面我们将介绍这些研究中的一些例子，以此说明各种技术的使用。更多的例子和详情请读者参阅具体的文献。

一、选择性载入CaSD的诱发信号

图16-10显示实验中通过在Schaffer侧枝内加压注射CaSDFura-2,可被选择性地运载到CA3区锥体细胞的突触前末梢（图16-6)。在CAl的辐射层（stratumradiatum)记录信号。当看到只有CA3区锥体细胞的轴突从注射位点延伸至记录位点，就证实载入是选择性的；一些中间神经元和胶质细胞也有可能有突起延伸到这个区域，但是它们的数量远不如轴突。选择性载入还可以通过用谷氨酸受体拮抗剂CNQX和D-APV阻断突触后活动来证实，这些拮抗剂阻断了突触后的反应但是不会影响CaSD信号，证实了信号来源于突触前。

图16-10B和16-10C显示了CaSD信号对Kd(以及々。^bff)的依赖性，用高亲和力的CaSD(Fura-2)和低亲和力的CaSD(Furaptra)测量同样的钙离子浓度瞬时变化，结果有所不同。两种指示剂都用于测量单个动作电位诱发的CA3-CA1突触前末梢的钙离子瞬时变化。低亲和力的指示剂Furaptra显然具有更快的动力学特性。一项结合了模型和实验的研究（Sinhaetal.1997)表明，在单个动作电位后，高亲和力的指示剂Fura-2可能被细胞膜附近局部高浓度的[Ca²⁺];所局部地饱和，而它的整体幅度仍然与局部浓度成比例。这样，Fura-2可用于研究单个动作电位诱发的突触前钙离子瞬时变化。然而，研究多个动作电位诱发的钙离子瞬时变化，选用低亲和力的指示剂如Furaptra则显得更为精明。

我们实验室广泛地使用这项技术进行以下研究：CA3-CA1突触的递质释放涉及哪种耗通道，在突触可塑性过程中突触前钙离子流如何变化，以及突触前钙离子在递质释放调制中所起的作用（WuandSaggau1997)。我们还用这项技术对海马脑片的其他组织选择性地载入染料；其他人员则用相似的技术（应用CaSD的局部扩散而不是注射)对海马脑片和小脑脑片进行选择性地装载染料。注射CaSD到alveus可以对突触前的CAl区维体细胞选择性地载入染料（RegehrandTank1991;WuandSaggau1994a)。注射CaSD到hilus可以对A3区的苔状纤维突触前的末梢载入染料（RegehrandTank1994;QianandSaggau未发表)。而且这种方法也可以对小脑平行纤维突触前末梢进行选择性载入染料（Mintzetd.1995)。

二、浸浴载入CaSD的诱发信号

图16-11显示的实验中以CaSD钙橙浸浴海马脑片，施加单个电刺激于Schefferce以诱发并记录CAl区的钙离子瞬时变化。因为指示剂是浸浴使用的，所以它不会被选择性地装载入突触前和突触后的神经元组织中。这一点可以通过施加离子型的谷氨酸受体拮抗剂CNQX和D-APV，以阻断突触后反应而不改变突触前活性，得以证实。各个细胞结构对整体CaSD信号的贡献依赖于两个主要的因素：①该结构中[Ca²⁺L变化量的大小；②该结构的体积Vi

第二个因素的出现是由于一个结构中指示剂分子的数目大致与该结构的体积成正比-对不同细胞结构对CaSD信号的贡献的详细讨论，请参考Sinha等（1995)。

图16-11C显示了如何使用这种技术来获得神经元活动时-空特性方面的信息。

CaSD信号首先出现在与刺激位点接近的树突区域，突触前末梢所在部位（图中所示左方)。信号从刺激位点开始传过fel片直到胞体所在的锥体层（stractumpyramidale),这是突触后胞体所在层。当有较多的CaSD装载入胶质细胞（Albowitzetal.1997)时，由于胶质细胞的[Ca2+];变化要慢得多，因此对这种瞬时变化的影响很小。

三、浸浴载入的VSD记录癫痫样的自发活动

光学记录技术十分适合于对神经元群体复杂活动的时-空反应特性的研究，例如研究癫癎样的自发活动。我们曾经用这项技术广泛地对海马脑片interictal癫痫样的自发活动的各个方面进行研究（ColomandSaggau1994;SinhaetaL1995，1996)。图16-12显示的实验例子是用VSDRH-414和PDM记录海马中间神经元网络的同步化活动。在加入K+通道拮抗剂4-氨基吡啶（4-AP，lOO/imol/L)后会自发地产生这种同步化活动,加入离子型谷氨酸受体拮抗剂CNQX和D-APV后，能够从interictal癫痼样的自发活动中分离出来这种同步化活动（Michelson and Wong1994; Sinhaetal.1996)。这种反应是由和GABAa受体有关的中间神经元的去极化反应所介导。光学记录技术使得我们可以研究该反应的时_空特性并把它和interictal癒痛样的自发活动进彳了对比（Sinhaetal.1996)。现在我们正在进一步研究该反应的特性、产生该反应的中间神经元的种类以及相应的机制。

正如上面对[Ca2+];和CaSD的讨论中提到的，使用VSD时PDM的单个元件记录到的活动实际上是该记录元件所覆盖范围内所有结构的瞬时膜电位的加权平均值。对只存在于细胞表面的VSD来说，加权仅限于组织表面面积Si

关于各个细胞结构对VSD信号的贡献的详细讨论，请参阅Sinha等（1995)的文章。

因为VSD信号给出的是多个细胞结构的膜电位平均值，所以有可能一些组结构超极化而另一些去极化，它们的活动互相抵消而造成没有活动的假象。这对CaSD信号来说并不是大问题，因为很少有生理活动会使得[Ca2Ii从静息水平快速下降。另外需要注意的是，由于记录的活动相对较慢的性质，PDM的交流耦合常数（1OOms)可能会对信号有影响-避免这个问题的方法是，使用强度分辨率足够高的模/数转换器，可如同用单光电二极管记录那样，只用直流耦合模式记录。注意：这种技术的敏感度不足以记录单个神经元的自发活动；只能记录一群神经元的活动。