荧光素原位杂交探测环境毒物导致的 染色体畸变和非整倍体实验

一、材料

1 玻片制备及材料固定

（1）干净的玻片。

（2）甲醇 -乙 酸 溶 液（3 : 1)

2 玻片上材料的预处理

3 靶和探针的变性

（1）变 性 溶 液（70% 甲酰胺-2X SSC) : 按 配 制 50m L 溶 液 ，加 人 35m L 去离子甲酰胺（K o d a k, Rochester, N Y )， 5m L 蒸偕水 ， 5m L 20 X S S C 的比例。用 H C l调 节 p H 至 7. 0。

（2） 热盘子。

4 原位杂交

（1）探针。

（2） 湿盒。湿盒可用一个干净的有盖塑料盒制备。将几张纸巾在水中浸透，铺在盒子底部。盖好盖子将盒子放进 37°C 培养箱。

（3） 玻璃盖玻片。

（4）玻璃盖玻片密封胶（橡皮胶水）。

5 杂交后漂洗

（1） 漂洗液： 5 0 % 甲 酰 胺（Fluka， B u c h s， S G , Switzerland) 溶于 2 X S S C 。按配制 I O O m L 溶液，加 50m L 甲酰胺， 10m L 20X S S C 和 40m L 蒸馏水的比例。调节 p H 至 7. 0。

（2）4 X S S C + 0 . 1 % T w e e n -20 溶液：力 n i O O m L 20X S S C 和 0. 5m L T w e e n -20 至总体 积 500m L 蒸馏水中，在磁力搅拌器上混匀，室 温（R T ) 保存 ，可至一个月。

6 探测和放大

7 复染

二、方法

1 玻片制备及材料固定

制备中期染色体涂片或间期核玻璃显微镜载玻片，依照实验室现用的标准细胞遗传学 程 序（见注释 2 和 3)。更多关于用于 F I S H 的中期和间期细胞制备的细节可以在参考文 献 18 和 1 9 中找到。

2 玻片老化

老化的目的是将生物材料固定于玻璃表面和使染色体结构对其后的 D N A 变性步骤具抵抗性。过于新鲜的制片，如果未经老化，会导致变性过程中大部分核, 染色体的丢失或染色体形状的扭曲变形。太长时间的老化则会降低杂交的效率（见注释 4)。老化玻片可在室温保持玻片 2〜3 天，或 65°C 过夜，或 90°C 加 热 30 min。

3 玻片上材料的预处理（见注释 5)

（6）将玻片放人用 P B S + M g C V 溶液溶解的 1 % 甲醛中，室温下孵育 lOmin。

（7）室温下用 P B S 漂洗玻片 5 min。

（8）将玻片在 7 0 % 、 8 5 % 和 100% 的冷乙醇系列溶液中漂洗脱水。所有漂洗都在染色缸中进行，每次 2mhi，从 70% 浓 度 开 始（见注释 6)。

（9）将玻片在空气中或空气喷嘴下风干。

4 靶和探针的变性

（1）预热盘子至 70°C 。

（2）在 I.5m L microfuge 管中准备每玻片 IOOjuL 变性液。变性液必须预热至 70°C 。

（3） 每个玻片上加 IOOfX L 变性液，盖好玻璃盖玻片（ 见注释 8)。

（4）将玻片放在 70°C 盘中变性 2 min (每次不超过 3 张玻片）（ 见注释 9)。

（5）立即将玻片浸人含 7 0 % 冷乙醇的染色缸中以除去盖玻片，冲洗 2m in。用镊子将盖玻片从染色缸中取出，用 8 5 % 和 1 0 0 % 的冷乙醇溶液重复冲洗。

（6） 将玻片在空气中或空气喷嘴下风干。

（7）37°C 预热探针 5 min (见注释 10)。

（8）柔和地漩涡混合并离心 2〜3s 收集管子底部的内容物。

（9）每张玻片用 30/^L 商品化探针，或者每 22m m X 22m m 面积用 IOm L 探 针（见注释 11)。将探针置于 0.5m L m i cr 〇 fUge 管 中（见注释 12)， 70°C 水浴变性 5 min。

（10） 立即将管子置于冰上直至使用。

5 原位杂交

（1）每个玻片用 30 ML 探针，盖上 20m m X 50m m 玻璃盖玻片（见注释 8 和 11)。

（2）用玻璃盖玻片密封胶围绕盖玻片周边密封盖玻片。

（3）置于湿盒中 37°C 孵 育 12〜16 h 。

6 杂交后漂洗

（1）用镊子小心地将密封胶除掉，不要移去盖玻片。盖玻片会在漂洗过程中脱落，用镊子取出染色缸中的盖玻片。依照探针数据说明书（ 见注释 14)，不同的探针需要不同程度的杂交和漂洗条件。因此，有两种杂交后漂洗方案：低严格度方案和高严格度方案。低严格度杂交后漂洗（以下所有溶液均要水浴预热）

（2）37° C 下 ，在含有 50m L 漂洗液的玻璃染色缸中漂洗玻片 3 次，每 次 5 min，断续振荡。

（3）42℃下，在 5 0mL PH 为 7 的 2 X SCC中 漂 洗 玻 片 3 次 ，每次 5min, 断续振荡。

（4）室温下，在染色缸中用 4 X S S C + 0 . 1 % T w e e n -20 溶液冲洗玻片。不要让玻片干 掉（见 注 释 16)。

高严格度杂交后漂洗（以下所有溶液均要水浴预热）

2』. 42°C 下 ，在含有 50m L 漂洗液的玻璃染色缸中漂洗玻片 3 次 ，每 次 5 min，断续搅拌。

3』. 60°C 下 ，在 50m L p H 为 7 的 0. I X S S C 中漂洗玻片 3 次，每 次 5m i n，断续振荡。

4』. 室温下，在染色缸中用 4 X SSC+ 0 . 1 % Tween-20 溶液冲洗玻片。不要让玻片干 掉（ 见 注 释 16)。

如果 D N A 探针是用荧光素-d U T P 标记的，立即进行复染（见 4. 9)。如果探针是用半抗原-d U T P 标记的，继续下面的步骤（探测）。

7 探 测（见注释 12)

（1）将玻片从 4X SSC+ 0 . 1 % Tween-20 溶液中取出，快速吸干边缘的多余液体。

（2） 每张玻片加 IOOfxL 封 闭 液（见注释 17 和 18)，盖上塑料盖玻片，湿盒中 37T：孵育 3Omin。

（3）用镊子小心地揭开盖玻片，倾斜玻片让液体短暂流下。可以用单一抗体或联合抗体探测探针。联合抗体可允许两种或两种以上不同半抗原-d U T P 标记的探针探测。

（4）每张玻片加 IOOuL 初 级（一次）抗体 [荧光素标记的卵白素和（ 或）荧光素-小鼠地高辛抗体 anti-D I G ) ] 重新盖上塑料盖玻片（见 注 释 1 9 和 20)。湿盒中37℃ 孵育 30〜60 min。

（5）37°C ， 50m L 4 X S S C +0. l% Tween-20 溶液漂洗玻片 3 次，每次 5 min，断续振荡。

8 放大

（1）每张玻片加 IOOuL 次 级（二次）抗 体 [生 物 素 化 的 卵 白 素 和（ 或）荧光素-小鼠地 高 辛 抗 体（ anti-D I G ) ] 重新盖上塑料盖玻片（见 注 释 1 9 和 20)。湿 盒 中 37°C解 育 30〜60m i n 。

（2）37°C 在 50m L 4 X S S C + 0 . 1 % T w e e n-20 溶液漂洗玻片 3 次，每 次 5 min，断续振汤。

（3）每张玻片加 I O O y L 三 级（三次）抗 体 [荧 光 素 标 记 的 卵 白 素 和（或）荧光素标记的小鼠地高辛抗体]，重 新 盖 上 塑 料 盖 玻 片（见 注 释 1 9 和 20)。湿 盒 中 37°C解 育 30〜60 min。

（4）37°C 在 5O m L 4 X S S C +0, 1 % T w e e n-20 溶液中漂洗玻片 3 次 ，每 次 5 min, 振荡 搅 拌（见注释 21)。

9 复染

用 碘 化 丙 啶

（1）每张玻片加 30juLPI/抗 褪 色 剂（2fig;mL) , 盖上玻璃盖玻片。

（2）用指甲油封闭盖玻片边缘（见注释 22)。 4° C 保存，可数月保持信号良好。

用 D A P I

（1）染色液中孵育玻片 lOmin。

（2） 2X SSC 中冲洗玻片 10 min 以洗脱残余染料。

（3）蒸馏水中漂洗玻片数秒以除去盐迹。

（4） 室温下空气风干玻片，加 30uL 抗褪色液。

（5）盖好玻璃盖玻片，用指甲油封闭玻片边缘（见注释 22)。 4°C 保存，可数月保持

信号良好。

1 0 玻片分析

1 0.1 染色体彩绘

染色体彩绘（图 2a，见图版）主要以生物放射量测定为目的，开发用于探测稳定的交换型畸变，如交互易位（5)。事实上，在固体染色染色体制片上的双着丝粒（非稳定畸变）的分析，对近期急性的辐射暴露的评估是非常可靠的，但是由于辐射后双着丝粒染色体的产生量随时间下降，所以不适用于慢性或过去暴露的评估 （20)。
对 彩 绘（固体染色也一样）的有丝分裂中期畸变的正确分析来说，着丝粒的发现可能

是关键，特别是在小鼠近端着丝粒染色体案例中：或者通过用 D A P I 复染，其自身在碱 性 『热变性后产生明亮的着丝粒异染色质信号；或者通过着丝粒 F l S H 染色。

在固体染色的有丝分裂中期，传统的命名法将每一个简单易位分类为一个单独的事件（例如一个双着丝粒加一个无着丝粒片段），并且区分完全（如果没有发现非重新结合断裂）和不完全交换（例如一个双着丝粒染色体没有无着丝粒片段）。彩绘技术的应用导致了新的命名系统的建立。这些新的命名系统主要基于荧光素结合探针和复染染料间颜色开关的识别。根据畸变鉴别和命名术语学草案（P A I N T ) (21)每个非正常染色的染色体或片段都用字母「A 」或 「a」分别描述，来表明复染的染色体材料。字母「B 」和 「b」用来表明彩绘的材料，大写字母表示含着丝粒的区域，小写字母表示无着丝粒的区域。因此，典型的 P A I N T 分类的畸变是 t (A b ) 、 die (A B ) 或 ace (ab)，这里 t 代表转位， die 代表双着丝粒， ace 代表无着丝粒片段。另一个独立发展的命名系统
是 Savage 和 Simpson (S & S ) 系 统 （2 2 ) , 这种方法选择从畸变形成的机械学角度来诠释。

当 F I S H 技术用于化学诱变剂 （6, 2 3 ) 导致畸变的分析时—在辐射研究中未有过的一种新型的畸变，在正确判定化学诱变剂所导致的影响时，必须纳人考虑范围：即一个或多个额外的全染色染色体出现在中期细胞，并伴随特定物种的整倍体染色体数目。这些额外的染色体来源于着丝粒周边区域的染色单体型交换，只出现在遭受辐射的G 2 期细胞。除非所有的染色体都与它们特异性地结合有不同荧光染料的探针杂交，并且用计算机化的图像分析系统来给它们中的每一个分配不同的颜色，通常整个核型只有一部分被染色，涉及着色染色体的畸变因而仅代表全部所致畸变的一部分。通过评估畸变的全部数量，来预测暴露的细胞或个体的命运也许就很重要。假定畸变在不同染色体上随机分布，为了将观测到的畸变数转换为总的畸变数对全部基因组的比值，就必须知道被每种颜 色 探 针（或鸡尾酒探针）所覆盖的染色体占全部基因组的比例。如果户代表基因组中被给定颜色所染色的比例， 9 为基因组被第二种颜色染色的比例，而 r 为基因组中染色的部分，可探测的交换部分则计算为： S = 2p 9+ 2 p r+ 2 gr。将测得的中期相的数目乘以 S ，就可以得到每个细胞（基因组）中的平均值。观测到的畸变总数和每个细胞中的平均数的比率给出畸变/基因组的估计频率。同样，假 定 TZ 是当全基因组可以用来
进行畸变扫描时已知的可测中期相数目， n/S 则表示着色中期相占全部可测中期相的比例 ，其所得的信息等价于 n 全分析中期相能够提供的信息 （24)。

IO.2 着 丝 粒 F IS H 染色

着丝粒 F I S H 染色通过测量染色体丢失和染色体不分离的发生频率，可以探测潜在的非整倍体诱变剂。

为了评估染色体丢失，特异性针对所有染色体着丝粒序列的探针被用于探测微核中着丝粒的存在。探针标记的微核定为着丝粒阳性（C + ) ，假定其含有一个或多个染色体 ，归其原因为前一个有丝分裂后期染色体的丢失。为了评估染色体不分离，用于探测特定染色体着丝粒（周边）区域的探针被用于评定一个双核细胞中，每个姐妹间期核中存在的染色体数目。实验中使用的是松胞菌素 B阻断的细胞，因而保留了一次有丝分裂的两个姐妹核在同一个细胞质中。在整倍体核中， Xf 任何常染色体，每种探针都应有两个斑点。发生于上一次有丝分裂中的未分离，可以通过探测异于姐妹核中应有的 2 + 2 形式的信号，如 3+ 1 或 4 + 0 组合的出现；男性细胞的 X 和 Y 染色体不分离则产生 2 + 0 形 式 的 信 号（图 2b ，见图版）。只有拥有正确杂交信号总数和相似荧光强度的细胞才被纳人分析。已有研究显示，染色体不分离可能是比染色体丢失更加敏感的非整倍体活性指标(25)。这表明，作为一种快速可靠的评定自发和诱发染色体不分离的方法，分裂间期细胞的分子细胞遗传学分析极具重要性。

10.3 用 于 端 粒 长 度 估 测 的 定 量 F I S H

1 0.3.1 定 量 的 图 像 分 析

端粒保护染色体的末端不发生端对端融合。端粒长度缩短超过临界长度会驱使细胞进人复制老化，或是染色体不稳定的原因。因此，端粒长度的测量是评定细胞寿命，或是研究物理或化学因素导致的染色体不稳定的有效途径。近来，一种新的原位技术：定量荧光原位杂交（Q -H S H ) 已经发展起来。这种可应用于有丝分裂中期和间期核的技术基于一种多肽核酸（P N A ) 端粒寡核酸探针的使用，该探针可比标准的 D N A 寡核酸
探针产生更强更多的特异性信号 （17)。目前， Q -F I S H 能够探测小于 Ikb ( 2 6 ) 的端粒个体长度差异。已有假定认为，端粒长度与其整合荧光强度值（IFI) 直接相关，因为使用的荧光探针可能与端粒重复序列定量杂交，从而能够探测很小的端粒长度差异。

数字图像由装备有多滤光片轮的荧光显微镜上的照相机所记录。图像获得必须使用专用的软件才能完成。数字图像获自 D A H 染色的染色体和 C y3 染 色 的 端 粒（图 2c，见图版)。 一 种专用的计算机程序（T F L -Telo 程序）被开发用于图像分析 （27)。简言之 ，染色体和端粒分别通过 D A P I 图像和 C y 3 图像分段鉴别，两个图像需结合起来进行像素移位校正。为了避免可能的选择偏移，中期相只在制备良好的染色体涂片上加以选择。

T F L -Telo 程序允许从单独的染色体和单独的端粒斑点制作轮廓线，两幅图像还可以成功结合。最终，每 个 染 色 体 上 端 粒 的 荧光强度可表达为荧光的任意单位（a.u. f. )

10.3.2 校正

为了确保对不同样本端粒长度可靠的定量评定，两个级别的校准必须被应用。首先 ，要校正日间灯光强度和排列的差异，荧 光 珠（橘黄珠，尺 寸 〇.2 Mm ; MolecularProbes， Eugene, O R ) 的图像是平行于细胞样本由计算机程序获得并分析的。其次,为找出荧光强度与 T 2A G 3 重复数目的关系，只有具有 10 和 80kb (分别是 L Y -S 和 L Y -
R 淋巴瘤细胞系）（2 8 ) 确 定（T 2A G 3)n 长度的哺乳动物细胞可以进行杂交和分析。以FI 值 和 L Y -S 与 L Y -R 细胞端粒长度线性关系的斜率为基础，细胞样本的端粒长度可在相同条件下获得它们的 IFl 值后进行评估。除了具有确定端粒长度的细胞系外，也可以选择使用插入了端粒序列、大小已知的质粒 （27)。

1 1 显微术滤光片设置

F I S H 的一个非常重要的部分是使用荧光显微镜和照相机系统对结果的显像和记录 。一个荧光显微镜含有一个激发荧光染料的光源和一个可以髙度透过荧光染料发射光的特殊滤光片。滤光片允许特定波长的光通过而阻断其他的光。因此，滤光片是为特定荧光素单独设计的，必须适当选择。碘化丙啶或 D A P I 滤光片应被用于扫描细胞或中期相涂片，而探针结合的荧光素的特异性滤光片则用于兴趣靶像的观察。表 2 给出了从显微镜制造商处选择滤光片的总的指导原则。

（1） 塑料盖玻片可以剪取一片 parafihn 膜制备。它们比玻璃盖玻片更容易从玻片上除去，因而除了那些需高温或密封设备不适于塑料的步骤外， parafilm 膜应被优先使用。

（2）为了制备中期染色体涂片，培 养 的细胞应用秋水仙酰胺（lO^g / m L Invitrogen,Paisley， UK) 处 理 3 h 。这个方案适用于很多细胞培养。对于细胞周期较短的细胞，比如小鼠细胞， 2 h 的秋水仙酰胺处理就已足够。对于生长缓慢的细胞，秋水仙酰胺处理时间应从 3 h 到过夜。秋水仙酰胺的浓度应与处理时间相适应：长时间处理需用较低的秋水仙酰胺浓度。为了在活体试验中得到中期相，对每只小鼠使用〇• S m L K T 3m 0I/L 秋 水 仙 碱 。制备双核细胞时，加 人 松 胞 菌 素 B
(3/i g Z m L ， Sigma-Aldrich) 到培养液中持续一”t•细胞周期。

（3）此方案推荐用于从实验性动物或人类获得的培养细胞和细胞悬液，用甲醇-乙酸(3 : 1 ) 固定。

（4） 玻片老化的条件始终与所使用的探针相关。因此，我们推荐按照探针数据说明书进行玻片老化处理。

（5）很多孵育都是在 50m L 玻璃染色缸中进行的。为获得最佳结果，将干净的温度计直接放入染色缸中来核对溶液温度。

（6）乙醇溶液用前应保存在一 20°C 。

（7）同时处理多张玻片时，每一张玻片都会导致热盘子的温度降低 1°C 。因此，对每一个需变性处理的玻片，热盘子的温度都必须设高 i°c 。

（8）应小心避免产生气泡。

（9） 时间和温度对保持染色体和核的形态非常重要。靶 D N A 的不完全变性会导致信号的缺失。推荐的方案已被证实对中期和间期的人细胞均有效，小鼠细胞需要高 达 80°C 的更高的变性温度。

（10）探针通常是用丙三醇或甲酰胺稀释的，且溶液非常黏稠。因此我们推荐将商品化探针在 37°C 预热来降低溶液的黏稠度。

（11）为节约起见，只有玻片上含有良好质量和数量的中期涂片或间期核的靶区域才被杂交。选择的区域可用钻石划线笔在背面做标记。

（12）我们推荐用铝箔包裹装有荧光素标记探针或荧光素标记抗体的管子，以避免光照。

（13） 如果在同一次杂交中，两个或多个探针要同时使用，最终的容量可能会超过适于 标 准 22 mmX22 mm 盖玻片的 1 〇 〜12 ML。 为解决这个问题，将混合探针的总容量在 840(^下离心 IOmin, 弃上清，将沉淀在空气喷嘴下或用速度真空离心风干，用 10〜12； xL 杂 交 缓 冲 液（Hybrisol YI， Roche) 重悬，将混合液加在玻片上。

（14） 温度、时间和杂交及杂交后漂洗溶液的缓冲液浓度很重要，低严格度会导致探针对其他序列的非特异性结合，而高严格度会导致信号缺失。

（15）此步骤最初是用于除去与细胞和染色体杂交的非特异性和（或）重复性的DNA。没有标准程序可参考，但有一些指导原则可以提供帮助。盐溶液的浓度越 低，漂洗持续得越长，温度越高，严格度就越高，就能除去更多的未结合或非特异性结合的探针。对于非常短的 DNA 探 针 （0.5〜3 kb) 或非常复杂的探 针（染色体彩绘探针），漂洗的温度应该低一些（最高 45。〇 , 严 格 度 也 低—些 （1〜2X SSC)。对于重复性探针（比如 cr 卫星重复），温度和严格度应该最高。

（16）如果需要，玻片在探测前可 4°C 保存 于 50m L 4 X SSC+0. 1 % Tween-20 溶液中达 2 周。

（17）除非特殊说明，探测溶液的容积是供 22 mmX50 mm 的整个玻片区域使用。如果只有 22 mmX22 mm 的区域被杂交，则将容积减到 1/3。

（18）BSA 能阻挡某些抗体对玻璃的非特异性结合，这对降低背景很重要，但也可能部分阻挡抗体与标记 D N A 的接触。

（19）对于购买的荧光标记抗体，原位杂交的抗体浓度应按照操作手册的指导。作为总的指导原则， lm g/m L 的抗体母液 1 : 1 〇〇稀释为探测液， 37°C 孵 育 30 min应该没问题。每次购买新抗体后都应该在不同稀释度下进行测试，以找到最佳的作用范围。从经验上讲，我们发现下列抗体在以下浓度进行原位杂交效果较 好：

a. 对生物素标记的探针：探测液中荧光卵白素 D C S (VectorLaboratories) 和罗丹明卵白素 D C S (VectorLaboratories) 为 1 : 300。探测液中生物素化的抗卵白素 D (Vector Laboratories) 为 1 : 1 〇〇。

b•对 D I G 标记的探针••探测液中小鼠抗-DIG (Roche) 为 1 : 100〜1 : 200。探测 D I G 抗 体（Roche) 为 1 : 1 〇〇。探测液中抗 D I G 罗丹明和抗 D I G 荧 光 素（Roche) 为 1 : 50。

（20）如果使用联合抗体，准备双重浓度的抗体溶液，在玻片上混合每种溶液 5C V L 。

（21）漂洗可在 37°C 或 42°C 下进行。应据经验决定最佳温度，除去过剩的和未结合

的探测反应物。

（22）指甲油可以提高 F I S H 玻片的存放时限

<