原理
RNA 样品经甲酰胺处理以及经含有甲醛的凝胶电泳分离可能会发生变性,这一方法是从 Lehrachetal. (1977), Goldberg (1980),Seed (1982a)和 Rosen et al, (1990) 修改而来。RNA 在含有 2.2 mol/L 甲醛的凝胶上电泳分离。
材料与仪器
RNA 样品 RNA 大小标准参照物
溴化乙锭 甲醛 甲酰胺 甲醛凝胶电泳加样缓冲液 MOPS 电泳缓冲液
琼脂搪凝胶 水平电泳仪 透明直尺 水浴
溴化乙锭 甲醛 甲酰胺 甲醛凝胶电泳加样缓冲液 MOPS 电泳缓冲液
琼脂搪凝胶 水平电泳仪 透明直尺 水浴
步骤
一、材料
1. 缓冲液与溶液
溴化乙锭(200 μg/ml)
甲醛
甲酰胺
10X 甲醛凝胶电泳加样缓冲液
10X MOPS 电泳缓冲液
2. 凝胶
含有 2.2 mol/L 甲醛的琼脂搪凝胶
3. 核酸和寡核苷酸
RNA 样品
RNA 大小参照物
4. 专用设备
水平电泳仪
透明直尺
55℃ 水浴
二、方法
1. 在一灭菌的微量离心管建立变性反应
RNA(多达 20 μg) 2.0 μl
10X MOPS 电泳缓冲液 2.0 μl
甲醛 4.0 μl
甲酰胺 10.0 μl
溴化乙锭(200 μg/ml) 1.0 μl
2. 盖紧微量离心管的盖子,于 55℃ 温育 RNA 液体 60 min,在冰水中冷却样品 10 min,然后离心 5s 并将所有的液体在微量离心管的底部沉淀。
3. 加 2 μl 10X 甲醛凝胶加样缓冲液并将试管重新置于冰上。
4. 将琼脂糖/甲醛凝胶装入水平电泳槽中,加入足够 1X MOPS 电泳缓冲液覆盖凝胶约 1 mm。电泳 5 min ( 5 V/cm)。加 RNA 样品到凝胶加样孔中,将空胶两侧的两条最外侧的泳道留下,加样 RNA 标准大小参照物。
5. 凝胶浸入 1X MOPS 电泳缓冲液中,4~5 V/cm 电压下进行电泳,直到溴酚蓝移出约 8 cm ( 4~5 h)。电泳时用较高电压会导致条带模糊不清。因为电泳缓冲液的 pH 值在电泳过程中会发生变化,装好电泳槽,缓冲液通过蠕动泵不断从一个室到另一个室。每隔一个小时更换一次缓冲液。
6. 将凝胶放置于一片 Saran 膜上在紫外线透射仪上观察 RNA 将染色凝胶和紫外线透射的照片用透明的直尺对比。
7. 照像并测量照片上每个 RNA 条带至加样孔的距离,以 RNA 片段大小的对数值对 RNA 条带的适移距离作图,用所得曲线计算从凝胶转移到固相支持体后通过杂交计算出 RNA 分子的大小。
8. 通过上或下毛细管转移固相化的 RNA 到固相支持物上。
1. 缓冲液与溶液
溴化乙锭(200 μg/ml)
甲醛
甲酰胺
10X 甲醛凝胶电泳加样缓冲液
10X MOPS 电泳缓冲液
2. 凝胶
含有 2.2 mol/L 甲醛的琼脂搪凝胶
3. 核酸和寡核苷酸
RNA 样品
RNA 大小参照物
4. 专用设备
水平电泳仪
透明直尺
55℃ 水浴
二、方法
1. 在一灭菌的微量离心管建立变性反应
RNA(多达 20 μg) 2.0 μl
10X MOPS 电泳缓冲液 2.0 μl
甲醛 4.0 μl
甲酰胺 10.0 μl
溴化乙锭(200 μg/ml) 1.0 μl
2. 盖紧微量离心管的盖子,于 55℃ 温育 RNA 液体 60 min,在冰水中冷却样品 10 min,然后离心 5s 并将所有的液体在微量离心管的底部沉淀。
3. 加 2 μl 10X 甲醛凝胶加样缓冲液并将试管重新置于冰上。
4. 将琼脂糖/甲醛凝胶装入水平电泳槽中,加入足够 1X MOPS 电泳缓冲液覆盖凝胶约 1 mm。电泳 5 min ( 5 V/cm)。加 RNA 样品到凝胶加样孔中,将空胶两侧的两条最外侧的泳道留下,加样 RNA 标准大小参照物。
5. 凝胶浸入 1X MOPS 电泳缓冲液中,4~5 V/cm 电压下进行电泳,直到溴酚蓝移出约 8 cm ( 4~5 h)。电泳时用较高电压会导致条带模糊不清。因为电泳缓冲液的 pH 值在电泳过程中会发生变化,装好电泳槽,缓冲液通过蠕动泵不断从一个室到另一个室。每隔一个小时更换一次缓冲液。
6. 将凝胶放置于一片 Saran 膜上在紫外线透射仪上观察 RNA 将染色凝胶和紫外线透射的照片用透明的直尺对比。
7. 照像并测量照片上每个 RNA 条带至加样孔的距离,以 RNA 片段大小的对数值对 RNA 条带的适移距离作图,用所得曲线计算从凝胶转移到固相支持体后通过杂交计算出 RNA 分子的大小。
8. 通过上或下毛细管转移固相化的 RNA 到固相支持物上。
来源:丁香实验