材料与仪器
麦胚凝集素（WGA)-琼脂糖 溶解的胰岛素受体 牛血清白蛋白 [125I] 胰岛素（受体级） 猪胰岛素 牛γ-球蛋白 聚乙二醇 6000 溶液 D 溶液 E 结合缓冲液
一次性小型塑料柱
一次性小型塑料柱
步骤
材料与设备
麦胚凝集素（WGA)-琼脂糖（~2.5 ml 沉积的微球）（Vector Laboratories,Inc.ALI023 或 EY Laboratories,Inc.A2101)
溶解的胰岛素受体（得自实验 2)
一次性小型塑料柱（Bio-Rad Laboratories）
牛血清白蛋白（BSA,1%)
[125I] 胰岛素（受体级）（DuPont NEN NEX 196)
猪胰岛素〔17.5umol/L(0.1 mg/ml)，于 0.001mol/L HCl 中〕（Sigma Chemical Co.I3505)
牛γ-球蛋白（0.4%, 于醇液 B 中）（Miles Laboratories,Inc，82-041-2)
聚乙二醇 6000(20% 水溶液）
试剂
溶液 D
溶液 E
结合缓冲液（溶解受体用）
(配方，见“试剂的配制”，PP.234?240)
操作程序
凝集素亲和层析
1) 用 25 ml 溶液 D 清洗 2.5 ml WGA-琼脂糖，去除未偶联的 WGA。
2) 将 10~15 mg 溶解的胰岛素受体（~5 ml) 与 2.5 ml 洗后的 WGA-琼脂糖混合，混合物在 4°C 下轻轻摇动 16 h 或室温 1 h。
3) 将琼脂糖倒入一次性小型塑料柱中，用 15 ml 溶液 D 淋洗。
4) 用 15 ml 溶液 E 洗脱胰岛素受体。分部收集 0.5-ml 组分，用微量蛋白测定法 (microprotdnassay）测定各组分的蛋白浓度。合并含蛋白浓度峰的组分；这通常可得到约 3 ml 0.3 mg/ml 的蛋白。
注：蛋白主峰通常在第 3~6 管组分即约 1/2 柱体积处，且峰形相当尖。应保持疑集累层析柱的试剂缓冲液和琼脂糖在相同的温度。使用不同温度的试剂，会产生气泡和引起柱内的不均-性，导致洗脱蛋白的分辨率下降。
胰岛素与部分纯化受体结合量的测定
1) 于微量离心管中建立如下反应体系:
A 管的结果给出总结合量，B 管的结果给出非特异结合量。特异结合量=A 管的 cpm 值-B 管的 cpm 值。
注：购自 DuPont NEN 公司的受体级 [125I] 胰岛素（NEX196) 的比活为 2200uCi/nmoL。胰岛素浓度为 35.5nmol/L。对于本试验，必须将 [125I] 胰岛素储液用缓冲液（50 mmol/L HEPES、0.1%Triton X-100、0.1% BSA,pH7.4) 稀释至 5nmol/L 对于部分纯化的受体来说，结合试验所需 [125I] 胰岛素的终浓度应为 500pmol/L, 这在 300-ul 反应体系中相丧于 30ul 5nmol/L 的溶液。
2) 上述反应体系 4℃孵育 16 h，或室温赋育 2 h。
3) 沉淀法将受体结合的胰岛素与游离的胰岛素分开。加 75ul 0.4% 牛γ-球蛋白，4℃ 孵育 5 min。再加 375420% 聚乙二醇 6000，4℃ 孵育 10 min。
4) 混合物用微型离心机离心 10 min，收集沉淀物。
5) 尽量去除各管上清后，计数测定沉淀物的放射性强度。
结果
用 WGA-琼脂糖亲和层析纯化溶解胰岛素受体的典型结果，如图 4-5 和表 5 所示。
麦胚凝集素（WGA)-琼脂糖（~2.5 ml 沉积的微球）（Vector Laboratories,Inc.ALI023 或 EY Laboratories,Inc.A2101)
溶解的胰岛素受体（得自实验 2)
一次性小型塑料柱（Bio-Rad Laboratories）
牛血清白蛋白（BSA,1%)
[125I] 胰岛素（受体级）（DuPont NEN NEX 196)
猪胰岛素〔17.5umol/L(0.1 mg/ml)，于 0.001mol/L HCl 中〕（Sigma Chemical Co.I3505)
牛γ-球蛋白（0.4%, 于醇液 B 中）（Miles Laboratories,Inc，82-041-2)
聚乙二醇 6000(20% 水溶液）
试剂
溶液 D
溶液 E
结合缓冲液（溶解受体用）
(配方，见“试剂的配制”，PP.234?240)
操作程序
凝集素亲和层析
1) 用 25 ml 溶液 D 清洗 2.5 ml WGA-琼脂糖，去除未偶联的 WGA。
2) 将 10~15 mg 溶解的胰岛素受体（~5 ml) 与 2.5 ml 洗后的 WGA-琼脂糖混合，混合物在 4°C 下轻轻摇动 16 h 或室温 1 h。
3) 将琼脂糖倒入一次性小型塑料柱中，用 15 ml 溶液 D 淋洗。
4) 用 15 ml 溶液 E 洗脱胰岛素受体。分部收集 0.5-ml 组分，用微量蛋白测定法 (microprotdnassay）测定各组分的蛋白浓度。合并含蛋白浓度峰的组分；这通常可得到约 3 ml 0.3 mg/ml 的蛋白。
注：蛋白主峰通常在第 3~6 管组分即约 1/2 柱体积处，且峰形相当尖。应保持疑集累层析柱的试剂缓冲液和琼脂糖在相同的温度。使用不同温度的试剂，会产生气泡和引起柱内的不均-性，导致洗脱蛋白的分辨率下降。
胰岛素与部分纯化受体结合量的测定
1) 于微量离心管中建立如下反应体系:
A 管的结果给出总结合量，B 管的结果给出非特异结合量。特异结合量=A 管的 cpm 值-B 管的 cpm 值。
注：购自 DuPont NEN 公司的受体级 [125I] 胰岛素（NEX196) 的比活为 2200uCi/nmoL。胰岛素浓度为 35.5nmol/L。对于本试验，必须将 [125I] 胰岛素储液用缓冲液（50 mmol/L HEPES、0.1%Triton X-100、0.1% BSA,pH7.4) 稀释至 5nmol/L 对于部分纯化的受体来说，结合试验所需 [125I] 胰岛素的终浓度应为 500pmol/L, 这在 300-ul 反应体系中相丧于 30ul 5nmol/L 的溶液。
2) 上述反应体系 4℃孵育 16 h，或室温赋育 2 h。
3) 沉淀法将受体结合的胰岛素与游离的胰岛素分开。加 75ul 0.4% 牛γ-球蛋白，4℃ 孵育 5 min。再加 375420% 聚乙二醇 6000，4℃ 孵育 10 min。
4) 混合物用微型离心机离心 10 min，收集沉淀物。
5) 尽量去除各管上清后，计数测定沉淀物的放射性强度。
结果
用 WGA-琼脂糖亲和层析纯化溶解胰岛素受体的典型结果，如图 4-5 和表 5 所示。
来源：丁香实验
