Sephacryl S-1000 层析法去除质粒 DNA 制备物中的小片段核酸

Sephacryl S-1000 层析是一个可供选择的将质粒 DNA 与小分子核酸（DNA 和 RNA ) 分离的方法。这一方法由波士顿麻省总医院的 F.DeNoto 和 H.Goodman 首先采用，后来由 Gomez-Marquez 等总结成论文发表于 1987 年。

DNA 样品
溴酚蓝蔗糖溶液 乙醇 酚 Sephacryl 平衡缓冲液 乙酸钠 TE 琼脂糖
Sorvall SS-34 转子或性能相同的其他转子

一、材料

1. 缓冲液和溶剂

溴酚蓝蔗糖溶液，乙醇，酚，Sephacryl 平衡缓冲液，乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2），含有浓度为 20 μg/ml RNase A 的 TE（pH 8.0）。

2. 凝胶

0.7% 琼脂糖，用 TBE 配制。

3. 核酸和寡核苷酸

DNA 样品，CsCl 密度梯度离心纯化。

4. 离心机和转子

Sorvall SS-34 转子或性能相同的其他转子

5. 专用设备

填装 Sephacryl 树脂的层析柱，Sephacryl S-1000 凝胶过滤树脂（Pharmacia)

二、方法

1. 准备一个 1x10 cm 的 Sephacryl S-1000 层析柱，用 Sephacryl 平衡缓冲液平衡。

2. 测定质粒制备物体积。加入 0.1 倍体积的 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2 ) 和 2 倍体积的乙醇，混匀，于 4℃ 放置 30 min。

3. 于 4℃ 以大于 10000 g（相当于用 Sorvall ss-34 转头 9100 r/min）离心 15 min 回收核酸，尽可能去掉上清，打开管口，在工作台上放置几分钟，使最后残留的痕量乙醇蒸发殆尽。

4. 用含有 RNA 酶Ⅰ的少量 TE ( pH 8.0 ) ( 至多 400 μl）重新溶解潮湿的质粒 DNA 沉淀，RNA 酶的终浓度至少为 100 μg/ml。

5. 质粒 DNA 溶液于室温下温育 1 h。

6. 用等体积的 TE ( pH 8.0 ) 平衡的苯酚抽提一次。

7. 吸取上层水相溶液，加 100 μl 溴酚蓝蔗糖溶液。将蓝色的一层溶液铺在 Sephacryl S-1000 层析柱上。

8. 将质粒 DNA 溶液装入层析柱，并用 Sephacryl 平衡缓冲液洗柱，立即开始 0.5 ml 组分的分部收集。

9. 当收集 15 个组分之后，用夹子夹住层析柱的底部，此时，蓝色的染料应刚好流经层析柱的一半。

10. 从各收集的组分中各取 10 μl 样品，用 0.7% 的琼脂糖电泳及溴化乙锭荧光染色来确定含有质粒 DNA 的组分。

11. 将含有质粒 DNA 的组分合并在一起，加 2 倍体积的乙醇，于 4℃ 沉淀 10 min。然后于 4℃ 以大于 10000 g 离心 15 min（相当于用 Sorvall SS-34 转头 9200 r/min）回收 DNA 沉淀。

12. 尽可能去掉上清，打开管口，在工作台上放置几分钟，使最后残留的痕量乙醇蒸发殆尽。

13. 用 TE ( pH 8.0 ) 溶解潮湿的质粒 DNA 沉淀。