材料与仪器
冰醋酸 三氟乙酸(TFA) 乙腈 溶剂 A(0.1%TFA) 溶剂 B(80% 乙腈+0.086%TFA)
反相高效液相色谱(HPLC) 仪 C18 反相 HPLC 柱
反相高效液相色谱(HPLC) 仪 C18 反相 HPLC 柱
步骤
材料与设备
反相高效液相色谱(HPLC) 仪
C18 反相 HPLC 柱(VYDAC?,4.6x250 mm)
冰醋酸
三氟乙酸(TFA)(2% 水溶液储液
乙腈
溶剂 A(0.1%TFA)(用 0.2-um 的尼龙膜过滤)
溶剂 B(80% 乙腈+0.086%TFA)(用 0.2-um 的尼龙膜过滤)
操作程序
1)用反相 HPLC 分析透析时和透析后所取的样品(见 P.149)。
2) 各样品取 100ul,加 5ul 冰醋酸,混匀。
注:若样品极浑浊或有沉淀,可在进样前用微型离心机离心。
3)C18 柱经 0.1%TFA/水/乙腈系统平衡后,进 50ul 经乙酸调节过的样品,215nm 检测。进样后,用溶剂 A 洗柱 5 min, 流速 1 ml/min。线性梯度洗脱:10 min 内从 100% 溶剂 A 至 100% 溶剂 B。再用溶剂 B 洗 3 min, 溶剂 A 洗 7 min。
4) 再进一系列稀释的(0.005~0.075%)N-十二烷基肌氧酸钠(SKL) 标准品,以 SKL 峰高为浓度的函数作图。根据样品的峰髙计算样品中 SKL 的浓度,并以样品中的 SKL 浓度为时间的函数作图。
5) 色谱柱使用后,先用 20 mlMilli-Q 纯水器制备的水冲洗,接着用 20 ml20% 甲醇冲洗,室温保存。
注:用 100 ml 缓冲液 A 和 5 冰醋酸配制一空白样品,按上述方法分析。这可用来校正从柱上洗脱下来的任何溶剂峰。
结果
典型的反相 HPLC 色谱图,见图 3-6。
反相高效液相色谱(HPLC) 仪
C18 反相 HPLC 柱(VYDAC?,4.6x250 mm)
冰醋酸
三氟乙酸(TFA)(2% 水溶液储液
乙腈
溶剂 A(0.1%TFA)(用 0.2-um 的尼龙膜过滤)
溶剂 B(80% 乙腈+0.086%TFA)(用 0.2-um 的尼龙膜过滤)
操作程序
1)用反相 HPLC 分析透析时和透析后所取的样品(见 P.149)。
2) 各样品取 100ul,加 5ul 冰醋酸,混匀。
注:若样品极浑浊或有沉淀,可在进样前用微型离心机离心。
3)C18 柱经 0.1%TFA/水/乙腈系统平衡后,进 50ul 经乙酸调节过的样品,215nm 检测。进样后,用溶剂 A 洗柱 5 min, 流速 1 ml/min。线性梯度洗脱:10 min 内从 100% 溶剂 A 至 100% 溶剂 B。再用溶剂 B 洗 3 min, 溶剂 A 洗 7 min。
4) 再进一系列稀释的(0.005~0.075%)N-十二烷基肌氧酸钠(SKL) 标准品,以 SKL 峰高为浓度的函数作图。根据样品的峰髙计算样品中 SKL 的浓度,并以样品中的 SKL 浓度为时间的函数作图。
5) 色谱柱使用后,先用 20 mlMilli-Q 纯水器制备的水冲洗,接着用 20 ml20% 甲醇冲洗,室温保存。
注:用 100 ml 缓冲液 A 和 5 冰醋酸配制一空白样品,按上述方法分析。这可用来校正从柱上洗脱下来的任何溶剂峰。
结果
典型的反相 HPLC 色谱图,见图 3-6。
来源:丁香实验